20世纪诞生以来，分子生物学迅速发展并在整个生命科学领域广泛渗透和应用，推动了传统医学进入基于分子层面实验科学的现代生物医学时代。核酸提取和纯化是分子生物学试验的基础，在以下应用实验中都需要进行核酸提取：
● 分析基础研究和疾病研究中的基因表达；
● 跟踪对药物治疗的反应(例如，在抗病毒治疗期间和之后监测病毒滴度）；
● 识别新物种并深入了解进化过程 (例如，Ancient DNA分析）；
● 对人类、动物和植物中引起传染病暴发的病原体进行监测和分类；
● 通过微生物检测和量化监测食品和水安全；
● 诊断疾病 (如基因疾病，癌症，免疫学缺陷）。
核酸纯化方法是影响提取核酸质量高低的最重要因素之一，也是下游分子生物学试验成败的关键，遵循提取纯化原则以及选择合适的纯化、浓缩方法，可以使核酸的质量及回收率达到最大化。
1.1 乙醇异丙醇沉淀法的原理是什么？
对于乙醇沉淀，您需要向溶液中加入两倍体积的冰冷的 96% 乙醇和盐（通常是乙酸钠）。乙醇降低介电常数，使糖磷酸骨架上的负电荷被乙酸钠的 Na+ 离子中和。由于核酸现在的亲水性降低，当您在冰上孵育混合物时，它们会从溶液中脱落。然后离心您的样品以将核酸与其他核酸分离，并在冷的 70% 乙醇中清洗沉淀以去除任何残留的盐分。再次离心样品，去除乙醇，让核酸沉淀干燥，然后将其重新悬浮在干净的水性缓冲液中。
要干燥核酸沉淀，可以将试管（打开盖子）放在层流罩几个小时，或使用真空离心机。必须确保颗粒完全干燥，以避免残留的乙醇对您的下游应用产生负面影响。
异丙醇沉淀非常相似。唯一的区别是您可以跳过冰上孵育步骤，并在第一步中用室温异丙醇代替冰冷的乙醇。关于异丙醇的体积，等于样品体积的量就足够了。
乙醇还是异丙醇更合适取决于样品体积、浓度和核酸片段的大小。如果大量样品，可能无法将两倍样品体积的乙醇加入试管中。异丙醇沉淀对于较大核酸片段和较低样品浓度的沉淀也是优选的，因为核酸在异丙醇中的溶解度较低。最重要的是，异丙醇沉淀是更快的方法，因为不需要在离心前孵育您的样品。
1.2 醇沉淀法优缺点有哪些？
虽然乙醇、异丙醇和乙酸钠非常便宜，并且有良好的核酸回收率。然而，整个过程非常耗时，并且由于需要手动执行，因此时间和人力成本是一个问题。
1.3 所需设备
乙醇或异丙醇沉淀所需的只是离心机和层流罩，或真空离心机来干燥颗粒。
2.1 凝胶电泳和离心柱纯化法是如何工作的？
首先需要进行琼脂糖凝胶电泳，请参阅<干货：一文读懂琼脂糖凝胶电泳实验>
可视化凝胶后使用手术刀截取感兴趣的核酸条带，使用合适的离心柱纯化试剂盒从 TAE 或 TBE 缓冲琼脂糖凝胶中纯化核酸条带。通常需要称量核酸条带的重量，每 100 mg 凝胶切片添加指定量的缓冲液，然后加热混合物以溶解琼脂糖。然后将样品转移到离心柱并纯化核酸使用结合、洗涤和洗脱步骤。由于可用的各种试剂略有不同，因此应遵循制造商的说明。
GBCBIO® C1105-琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 Gel Extraction Kit 适合于从各种浓度各种类型的琼脂糖凝胶中回收100bp-20Kb的DNA片段，回收效率高达85%。纯化过程不需要用到任何危险的有机物抽提或耗时的乙醇，异丙醇沉淀。纯化产物可直接用于做连接、PCR、测序、限制性酶切，或者各种各样的标记反应。该试剂盒也适合于从酶切产物，PCR产物中高效回收DNA。
2.4 凝胶电泳和离心柱纯化法操作步骤 (以--C2105-DNA-Pure Kit--为例)：
1.建议您使用新鲜的TAE或者TBE缓冲液作为电泳缓冲液。不要重复使用电泳缓冲液，因为会因其pH的升高而影响实验。
2.将单一的目的DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
3.加入3倍体积的Buffer NJ：如凝胶薄片的重量为0.1g, 则其体积为0.1 ml，加入300μl的Buffer NJ，于55-65℃水浴中至凝胶完全融化。
重要提醒：在凝胶完全溶解之后，观察混和物的颜色，如果是粉红色，则要加入5μl 浓度为3 M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。经过这一调节，该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。
4.可选步骤：对小于100bp的片段，融化后加入与胶等体积的异丙醇（如胶重0.1g，加入0.1ml异丙醇），混匀。
5.将上一步所得溶液加入到GBC吸附柱上（注意：吸附柱容积为800μl，若样品体积大于800μl可分批离心后加入）。室温下放置2min后，10,000xg离心60秒。弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。
6.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中。室温下10,000xg离心30-60秒。
注意：浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下。
7.重复用600μl DNA Wash Buffer洗涤柱子。室温下10,000x g离心30-60秒。
8.弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,13,000 x g离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。
9.把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入35~50μl（具体取决于预期的终产物浓度）Elution Buffer到柱基质上，室温放置1min, 12,000x g离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出80-90%的结合DNA。如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA洗脱出来，不过那样的浓度就会较低。
DNA 浓度及纯度检测
回收得到的DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA 应在OD260 处有显著吸收峰，OD260 值为1 相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD260/OD280 比值应为1.7~1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH 值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
2.3 凝胶电泳和离心柱纯化法的优缺点
这种核酸纯化方法的巨大优势在于琼脂糖不会使核酸变性，因此很容易从凝胶中回收它们而不会造成任何伤害。但是不适合高通量实验室，因为运行凝胶非常耗时，并且仅限于少量样品。
2.4 凝胶电泳和离心柱纯化法所需设备
与其他纯化方法相比，此工作流程需要许多不同的仪器。琼脂糖凝胶电泳需要凝胶电泳系统、外部电源和生物安全柜，因为您将使用危险的嵌入染料如EthBr。离心柱纯化要求不高只需要一台离心机。因手套被几滴液体污染，教授中毒丧生…… 警惕实验室的“沉默”杀手
3.1 离心柱纯化法是如何工作的？
如上所述，离心柱纯化方案包括结合、洗涤和洗脱步骤。将样品转移到离心柱中后，将它们离心以将核酸结合到柱内的膜上此过程将不需要的成分滤过纯化柱。使用洗涤缓冲液的几个额外的离心步骤去除残留的不需要的材料，使用洗脱缓冲液的最后离心步骤将核酸从膜中释放出来。
GBCBIO® C2105-PCR/酶切产物纯化试剂盒 DNA-Pure Kit 采用独特的离心吸附柱纯化酶切、PCR等反应溶液中的DNA片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子及寡核苷酸引物等杂质。本试剂盒适用于回收100 bp–40 kb ，起始量为1-5 μg的DNA片段，回收率可达80%以上（<100 bp 或>10kb 的DNA片段回收率为30－50%）。使用本试剂盒回收的DNA 可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化等实验。
3.2 离心柱纯化法操作步骤（以--C2105-DNA-Pure Kit--为例 ）：
操作步骤
1. 估计PCR 反应液或酶切反应液的体积，向其中加入1.5倍体积的Buffer DPX（无需去除石蜡油或矿物油）。如果PCR产物体积小于20μl，则需用灭菌去离子水补加到20μl，再加入30μl Buffer DPX。
2. 将上一步所得溶液加入一个GBC吸附柱中（吸附柱放入收集管中），室温放置2分钟，12,000 rpm (~13,400×g )离心30 秒，倒掉收集管中的废液，将GBC吸附柱放入收集管中。
注意：吸附柱容积为800μl，若样品体积大于800μl可分批加入。
3. 向GBC吸附柱 中加入600μl DNA Wash Buffer（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30秒，倒掉收集管中的废液，将GBC吸附柱放入收集管中。
4. 向GBC吸附柱 中加入600μl DNA Wash Buffer，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
5. 将GBC吸附柱放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 分钟，尽量除去漂洗液。
注意：Wash Buffer中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。
6. 将GBC吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μl Elution Buffer，室温放置2分钟。12,000 rpm (~13,400×g )离心1 分钟收集DNA 溶液。
注意：洗脱液的体积不应少于30μl，体积过少会影响回收的效率。洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内(可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围)，pH 值低于7.0 会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃以防降解。
DNA浓度及纯度检测
回收得到的DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA 应在OD260 处有显著吸收峰，OD260 值为1 相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD260/OD280 比值应为1.7~1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH 值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
3.3离心柱纯化法优缺点
这种纯化方法既快速又简单。最重要的是，它可以适应您的样品数量，但是，膜可能会堵塞，并且由于需要 30-50 μl 的最小洗脱体积，因此您可能会得到相当低的核酸浓度。
3.4离心柱纯化法所需设备
离心柱纯化所需的唯一设备是离心机。
4.1 磁珠纯化法是如何工作的？
使用磁珠的纯化工作流程与提取工作流程非常相似。您首先添加将核酸结合到样品上的磁珠。
然后将试管放在磁铁上，去除含有不需要的未结合物质的上清液。您重复此步骤几次，在其间更换洗涤缓冲液。最后，您添加洗脱缓冲液并将样品转移到不同的容器中。与使用磁珠的提取方案相比，在纯化过程中只有特定长度的核酸片段与磁珠结合。这种尺寸排阻机制是通过为感兴趣的核酸片段创造完美的结合条件，通过改变缓冲液、盐和它们的浓度以及因此的亲水性/疏水性来实现的。
GBCBIO® R1205-病毒DNA-RNA纯化试剂盒 Virus DNA-RNA Isolation Kit 试剂盒是专门用于从血浆、无细胞体液、病毒原液和感染病毒的组织中提取各种病毒（Virus）RNA/DNA 的小量纯化试剂盒。试剂盒采用了独特的病毒裂解系统，由病毒裂解液裂解病毒释放 RNA 或DNA，再结合核酸制备膜技术纯化 RNA 或 DNA，适用于各种 RNA 或 DNA 病毒的核酸提取。本试剂盒具有高效、快速、方便之特点，病毒裂解后，提取操作仅需 20 分钟便可完成。本试剂盒配有 Carrier RNA可提取样品中微量的 RNA/DNA，提取得到的 RNA 可用于RT-PCR 反应、Northern 杂交等多种分子生物学实验。
4.2 磁珠纯化法操作步骤(以--R1205-Virus DNA/RNA Isolation Kit--为例)：
1. 病毒的裂解，使用不同的实验材料需采用不同的裂解步骤，具体说明如下：
A. 血浆、血清、无细胞体液、病毒原液中病毒的裂解：取10～200 μl的血浆、血清、无细胞 体液、病毒原液，如果起始量不足200 μl，用 PBS 溶液或 RNase free dH2O 补足至 200μl。
B. 感染病毒的组织的裂解：取10 mg感染病毒的组织进行液氮研磨，研磨后的组织加入200μl PBS 溶液或 RNase free dH2O。
C．咽拭子（含保存液）：剧烈涡旋1分钟，取200μl进行实验。
D．咽拭子（干）：加500μl Buffer VL、10μl Proteinase K最高速度涡旋15秒充分混匀。56℃孵育10分钟后，最高转速离心1min，取350μl上清，加入2.0μl Carrier RNA，从第三步起继续实验。
2.加入200μl Buffer VL、10μl Proteinase K和2.0μl Carrier RNA，最高速度涡旋15秒充分混匀。
3. 56℃孵育10min。
4. 加入400μl无水乙醇（96-100%，室温）至裂解液中，最高速度涡旋20秒混匀。将柱子稍微离心以收集盖子上的液滴。
5. 把GBC吸附柱装在在2ml收集管中（已提供），将第4步得到的溶液全部转入柱中，10,000×g离心1min，倒弃流出液重新套上收集管。
6.加入500μl Buffer WB（Buffer WB使用前须要用无水乙醇稀释）至柱子中，10,000×g离心1min，弃去流出液。
7. 将GBC吸附柱重新套回2ml收集管中，加入600μl RNA Wash Buffer至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；
注意：RNA Wash Buffer使用前须要用无水乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室温。
8.再加入600μl RNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g离心1min,弃去流出液；
9. 将GBC吸附柱重新套回2ml收集管中，最大转速（>13.000×g）离心空结合柱1min以干燥柱子的基质；这一步对下面的洗脱步骤至关重要。
10. 将柱子置于1.5ml灭菌离心管，加入30-50μl DEPC-Water至柱子的膜中央，室温静置于3min；
11. 室温下，离心(>13.000)1min，以洗脱DNA/RNA。保留含DNA/RNA的流出液。将DNA/RNA储于-20℃。
注意：为增加得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2分钟，1,2000rpm离心2分钟。
4.3 磁珠纯化法优缺点
磁珠纯化的一个巨大优势是可以根据您的预算选择所需的设备。
选项 1：获取磁性支架并手动执行工作流程。这是最便宜的选择，但也是最乏味和最容易出错的方法。您需要非常小心不要吸入珠子，因为这会导致样品损失。
选项 2：对于高通量应用，可以购买自动移液系统96 或 384 等多通道移液器。这些设备减少了手动液体处理步骤，提高了生产率和可重复性，也可用于其他应用。
选项 3：通过购买专用纯化系统自动化整个工作流程。
磁珠纯化的另一个方便之处在于，可以使用比旋转柱纯化更低的洗脱体积，而且它更易于扩展，因为您可以将它与 384 孔板一起使用。
4.4 磁珠纯化法所需设备
如前所述，您可以将磁珠纯化设备与您的预算相匹配。如果预算有限，可以购买磁性支架，如果有更多资金，自动移液系统96 或 384 等多通道移液器，或者使用专用的纯化系统。
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品牌优势
捷倍斯生物可以提供专业和完善的核酸分离纯化解决方案，有硅胶柱法、磁珠法与溶液直接法的核酸纯化产品，在二代测序的样品前处理方面有着专业的技术与积累，有完善的针对唾液、血液与血浆等样品的保存、运输与高通量核酸纯化等整套的解决方案。 在诊断试剂原料方面，捷倍斯生物可以提供生物染色剂、高端的表面活性剂、显色底物、生物缓冲剂以及酶制剂与其稳定剂等系列产品。
做值交往的人｜做值得信赖的产品
