质粒是在细菌和其他细胞中发现的一种小型、环状DNA 分子。通常只携带少量基因，特别是一些与抗生素耐药性有关的基因；另外质粒可以在不同的细菌细胞之间传递因为质粒分子本身具有复制功能的遗传结构，可携带一些遗传信息，并且其自我复制能力和携带遗传信息能力非常强大，经过基因表达后可使其宿主细胞表现相应的性状，所以质粒常被用作基因载体，在分子生物学、生物化学与细胞生物学等学科中得到广泛的应用。
细菌基因组DNA和质粒
质粒是怎么被发现的？
质粒的结构是什么样的？
Origin of Replication (ORI) 复制起始位点：通过募集复制相关蛋白在质粒内启动复制。
Antibiotic Resistance Gene 抗生素抗性基因：筛选含有质粒的细菌，例如：Ampicillin，Kanamycin。质粒含有抗生素抗性基因，而没有质粒 DNA 的细菌将无法在含有抗生素的LB培养板中存活。
Multiple Cloning Site (MCS) 多克隆位点：包含数个限制性酶切位点，可通过限制性酶消化和连接轻松插入目的DNA。在表达质粒中，MCS 通常位于启动子的下游，因此当基因插入 MCS 时，其表达将由启动子驱动。一般而言，MCS 中的限制性位点是独一无二的，并不位于质粒骨架的其他位置。因此，酶切时并不会破坏质粒载体其他部位的结构。
Insert 插入片段：插入片段是克隆到 MCS 中的基因、启动子或其他 DNA 片段，通常是人们所希望研究的遗传元件。
Promoter Region 启动子：驱动目标基因的转录。启动子的选择需要与质粒表达的物种相匹配。例如：如果打算在人细胞中使用质粒，则启动子将是人或哺乳动物启动子序列。而在大肠杆菌中使用质粒，则将是原核生物启动子序列。选择组织特异性启动子，则可以实现目的基因的组织特异性表达。启动子的强度与目的基因的表达水平密切相关。
Selectable Marker 选择性标记：筛选已经成功摄取质粒的细胞。注意该选择性标记区别于细菌中的抗性筛选。细菌抗性基因筛选用于质粒扩增过程，选择性标记用于筛选或标记转染后的细胞。选择性标记通常是抗性筛选或者荧光蛋白。
Primer Binding Site 引物结合位点：短的单链 DNA 序列，用作 PCR 扩增或测序的起始，验证质粒序列。
正常质粒是双链闭合的DNA。但在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂、开环、或由开环解开螺旋变成线形，多数质粒提取物中含有三种构型的质粒。
1.共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋状态。
2.开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子。
3.线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子
电泳时，由快到慢依次是：超螺旋＞线性DNA＞开环DNA。
不同大小质粒提取后电泳胶图
图源：https://www.bilibili.com/read/cv26391422/
质粒有哪些分类和用途？
Cloning Plasmids 克隆质粒：用于促进 DNA 片段的克隆。克隆载体往往非常简单，通常只包含细菌抗性基因、复制起点和 MCS。
Expression Plasmids 表达质粒：用于基因表达（基因功能的研究）。表达载体必须包含启动子、转录终止子序列和插入基因。启动子驱动插入DNA 转录生成RNA，合成的RNA上的终止子序列发出停止转录过程的信号。表达载体可以通过增强子序列增加蛋白质或RNA的产量。表达载体可以在各种细胞类型（哺乳动物、酵母、细菌等）中驱动表达，这在很大程度上取决于用于启动转录的启动子。
Gene Knock-Down Plasmids 基因敲减质粒：用于减少内源基因的表达。通过表达靶向目的基因 mRNA的shRNA来实现。这些质粒具有可以驱动短 RNA 表达的启动子。
Genome Engineering Plasmids 基因工程质粒：用于靶向和编辑基因组。通常使用 CRISPR 技术完成。
Reporter Plasmids 报告质粒：用于研究遗传元件的功能。这些质粒包含一个报告基因（例如，荧光素酶或GFP），可提供遗传元件活性的读数。
Viral Plasmids 病毒质粒：通过修饰的病毒基因组，有效地将遗传物质递送到靶细胞中。可以使用这些质粒来制造病毒颗粒，例如慢病毒、逆转录病毒、AAV 或腺病毒颗粒，从而高效感染靶细胞。
拷贝数是什么？
拷贝数是指每个细菌/细胞内质粒的个数，决定了最终所能获得质粒的量。对于质粒载体，拷贝数是我们最关心的特性之一。实际上，每个细菌中的质粒的拷贝数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：
严紧型质粒：当细菌染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细菌内只含1～2个质粒；
松弛型质粒：当细菌染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细菌内一般含20个左右质粒拷贝。这些质粒的复制是在寄主的松弛控制之下的，每个细菌中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还可使质粒拷贝数增至几千份。
当然，恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、质粒的大小及培养条件有关。
那么到这里你可能会问，高拷贝质粒我们可以多提一点质粒，低拷贝数的质粒有什么作用呢？确实，低拷贝数的质粒用途不是十分广阔，主要用于以下两点：
质粒的接合转移与穿梭质粒
质粒的接合转移：是细菌遗传物质转移的一个重要方式。在质粒转移过程中，供体菌和受体菌通过结合作用紧密接触，质粒从供体细胞向受体转移，同时进行质粒复制。按能否自主转移，可以将天然存在的质粒分为转移型质粒和非转移型质粒两大类。
这里要注意的是，获得质粒的细菌可随之而获得一些生物学特性，如耐药性或产生细菌素的能力等。从环境友好出发，实验室里的废弃菌液，一定要灭过菌才能倒哦！
通俗来说，就是一山不能容二虎。但是作为科学来说，我们需要一个严谨的定义。
“利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向自细胞的分配过程中彼此竞争，这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处，这种现象称之为不相容性”。
那要怎么才能在一个菌里面使用两个质粒呢？
pUC ori：复制起始点，pUC为高拷贝表达质粒（120-200个/细胞）。
Amp：氨苄抗性，为原核抗性，用于质粒抽提时的筛选。
U6 promoter：U6启动子，真核启动子，启动shRNA的表达。
CMV：真核启动子，启动ZsGreen1的表达。
ZsGreen1：第三代绿色荧光蛋白，亮度最高的的荧光蛋白。
PGK：真核启动子，启动Puro的表达。
Puro：嘌呤霉素抗性基因，真核抗性，用于质粒或病毒进入细胞后的筛选。
Amp：氨苄抗性基因，原核抗性，用于质粒抽提时的筛选。
WPRE：转录后调控序列，增加外源片段的表达效率。
质粒提取原理简介
质粒DNA提取的方法有很多，包括碱裂解法、酚氯仿裂解法以及煮沸法等。不论哪种方法从细菌中提取质粒的步骤主要包括三个，即：将细菌进行收集并裂解、释放出细胞中的DNA、分离和纯化质粒DNA。
质粒的提取是分子克隆中常用的一种技术，即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒的过程。质粒的质量直接影响到基因操作的后续步骤，如转化、酶切和序列分析等，因此获得足够量的质粒是质粒应用的重要一步。生物学实验中质粒的获取方式主要是通过在大肠杆菌中扩增，从而获取大量的含有目的基因的载体质粒。其主要过程是对感受态细菌进行转化，挑取克隆菌落，在LB培养基中摇菌进行扩增和质粒抽提。科研工作者已经开发出很多质粒抽提的方法，目前普遍采用的质粒提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法和有机溶剂法等。碱裂解法提取质粒具有得率高，适用面广、快速、纯度高等特点，因此碱裂解法目前被广泛采用。下面着重介绍碱裂解法提取质粒的原理。
碱裂解法提取质粒主要原理是利用共价闭合环状质粒和线性染色质在拓扑学上的差异。利用NaOH和SDS溶液使细胞裂解，在碱性溶液中，线性的大分子量细菌染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离。当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，它们之间交联形成不溶性网状结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结合沉淀下来。通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA小分子量的RNA留在上清液中，混杂的RNA用RNaseA除去。一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。由于碱裂解法的众多优势，市面上大多数的质粒抽提试剂盒基本采用的方法是碱裂解法。
碱裂解法（以下溶液配方仅供参考）
碱裂解法提取质粒用到三种溶液：
溶液 I：50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH 8.0；
溶液 II：0.2N NaOH，1% SDS；
溶液 III：3 M 醋酸钾，2M 醋酸。
溶液 I 的作用：
1）任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此需要用适当浓度及pH值的Tris-HCl溶液。
2）加入的葡萄糖只是让悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。因此，如果溶液 I 中缺少葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，是几乎没有任何影响的。
3）EDTA 是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在分子生物学试剂中的主要作用是抑制DNase的活性，以及抑制微生物生长。
Tips：此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液 II 的作用：
1）通常用新鲜的0.4N NaOH和2％ SDS等体积混合后使用的。建议用新鲜的0.4N NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2 而减弱了碱性。因为溶解细胞的最佳试剂是NaOH，而不是SDS。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer （双层膜） 结构向micelle（微囊） 结构的相变化所导致。
2）如果只用SDS也能抽提到少量质粒，因为SDS也是碱性的，但碱性相对弱。加 SDS 是为下一步操作做铺垫。
Tips：此步骤注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下，基因组DNA片段会慢慢断裂；第二，必须轻柔混合，否则也会导致基因组DNA断裂。
溶液 III的作用：
1）SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS又能与蛋白质结合，因此沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度盐使沉淀更完全。同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。
2）2M 醋酸是为了中和NaOH，长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂，小于100kb的片段就不容易与PDS共沉淀。因此，碱处理时间要短，而且不能激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量基因组DNA污染。
02 煮沸法
其原理是：染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性,共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。
03 试剂盒法
其原理是：通常采用改良的SDS-碱裂解法，结合硅胶膜在高盐及低pH值（pH < 7.5）时可结合DNA，在低盐及高pH值（pH≥8）条件下洗脱的原理达到快速纯化质粒DNA的目的。
大多数实验室都会选择基于碱裂解法的质粒提取试剂盒来提取质粒，根据不同的样本量及获取目标质粒的产量分为质粒小提、质粒中提、质粒大提。
质粒小提
质粒小提主要是对于1-5mL的菌液中质粒DNA进行小量提取，获得的质粒用来进行常规的载体构建实验。
GBCBIO金牌产品：
P2105 无内毒素质粒小量提取试剂盒 Endo-free Plasmid Mini Kit |
采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，粗提物通过过滤柱除去内毒素；
离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
独有的去蛋白液配方，可以高效去除核酸酶。即使是核酸酶含量丰富的菌株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。
独特的内毒素去除液能有效去除内毒素。
质粒中提
质粒中提是在质粒小提的基础上进一步去除菌液中的内毒素，获得的质粒可以用于细胞转染，常规需要菌液量为5-15mL。
质粒大提
质粒大提与中提方法相同，一次可对200-500mL菌液进行抽提，从而获得大量质粒。
GBCBIO金牌产品：
P4101 无内毒素质粒大量提取试剂盒 Endo-free Plasmid Maxi Kit |
高效提取中大量菌液质粒DNA，提取菌液量：5mL、10mL、20mL、50mL、100mL或以上；
提取质粒DNA纯度高，可高效去除质粒中污染的内毒素，内毒素去除率可高达90%以上，有效提升质粒转染实验的成功率；
真空浓缩，大幅提升洗脱液中质粒DNA浓度，DNA浓度可达2ug/uL以上；
用于培养菌液样本中质粒DNA的提取，提取后的质粒DNA可用于细胞转染、酶切、PCR、测序、体外转录与翻译、构建文库等多种分子生物学实验。
GBCBIO质粒小提、中提、大提产品：
P1105 质粒小量提取试剂盒 Plasmid Mini Kit |
| 从1-5ml菌液中提取获得高达35ug的高纯度的质粒DNA。在传统的碱裂解法抽提质粒的基础上，结合了柱纯化核酸技术，适合于从1～5 ml细菌培养物中提取多至35 μg 高纯度的质粒DNA。 |
P7105 质粒中量提取试剂盒 Plasmid Midi Kit在传统的碱裂解法抽提质粒的基础上，结合了柱纯化核酸技术，适合于从5～15 ml细菌培养物中提取多至70μg 高纯度的质粒DNA。两次不同洗涤液洗涤纯化柱的设计，更彻底地去除菌体中所含的各种杂质，适用于各种要求的分子生物学 |
P3105 质粒大量提取试剂盒 Plasmid Maxi Kit用从小于250ml培养过夜的细菌培养液纯化高达500μg质粒DNA |
P2105 无内毒素质粒小量提取试剂盒 Endo-free Plasmid Mini Kit独特的内毒素去除液能有效去除内毒素。两种不同洗涤液的设计，彻底去除残留的蛋白，适用于各种不同来源的宿主菌中质粒DNA的分离纯化。 |
P4105 无内毒素质粒大量提取试剂盒 Endo-free Plasmid Maxi Kit内毒素(Endotoxin)是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖，它能引起哺乳动物发热，甚至会导致动物休克。常规的质粒纯化试剂盒由于无法去除内毒素的污染，从而大大降低了质粒转染的效果 |
P6105 酵母质粒提取试剂盒 Yeast Plasmid Kit酵母质粒抽提试剂盒(Yeast Plasmid Kit)采用了一种新型的硅胶柱。在特定条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条件下又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。 |
P5105 质粒大量提取试剂盒（非柱式法） QS Plasmid Maxi Kit质粒大量试剂盒（Relax-ISO Plasmid Maxi Kit）是一种简单方便的提取和纯化质粒的产品。能方便、快速纯化出高至500μg高纯度质粒DNA，纯化过程不需用到昂贵的设备。 |
质粒提取有哪些常见问题？
1. 质粒提取的得率低或无质粒
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菌体老化：重新涂布筛选，挑选新的菌落进行液体培养。 -
质粒拷贝数低：筛选新的高拷贝的菌体。 -
碱裂解不充分：收集的菌体含量较高时，可以酌情提高溶液1，2，3的含量。 -
乙醇残留，漂洗液没有去除干净。 -
洗脱处理不当：洗脱液加入较多或者洗脱时间过短。
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混有RNA，RNase A处理不彻底。 -
混有基因组DNA。避免加入溶液2，3时剧烈震荡。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法 -
温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长也会导致细胞和DNA的降解。
品牌优势
捷倍斯生物可以提供专业和完善的核酸分离纯化解决方案，有硅胶柱法、磁珠法与溶液直接法的核酸纯化产品，在二代测序的样品前处理方面有着专业的技术与积累，有完善的针对唾液、血液与血浆等样品的保存、运输与高通量核酸纯化等整套的解决方案。 在诊断试剂原料方面，捷倍斯生物可以提供生物染色剂、高端的表面活性剂、显色底物、生物缓冲剂以及酶制剂与其稳定剂等系列产品。
做值交往的人｜做值得信赖的产品
