游离DNA（Circulating free DNA or Cell free DNA，cfDNA），循环游离DNA或者细胞游离DNA，是释放到血浆中的降解的DNA片段。cfDNA存在于人体的各种体液中，随组织损伤、癌症和炎症反应等发生浓度变化。母亲和胎儿-胎盘单位都会产生cfDNA，正常人体的cfDNA主要通过细胞凋亡过程中产生的小而均匀的185~200 bp小片段DNA。而肿瘤坏死的组织细胞由于非正常的凋亡过程，导致产生大小不同且大于200 bp的大片段DNA。循环中的cfDNA分子被迅速清除，半衰期为1小时或更短。
游离核酸的来源
1947年，Mandel和Metais首次报道了外周血中存在cfDNA。生理情况下，血液中的cfDNA主要来源于白细胞的坏死和凋亡，在某些疾病和特殊状态下，其他细胞也会释放游离DNA入血，包括来源于肿瘤细胞的循环肿瘤DNA（ctDNA）和来源于胎儿的cfDNA等。血液不是可用于液体活检的唯一体液，例如尿液、粪便、脑脊液（CSF）、唾液、胸水和腹水都是潜在来源，可从中获得肿瘤来源的物质（包括cfDNA）。
cfDNA的生物学特点:
ctDNA检测是目前市场上最常见的液体活检形式，它在具备巨大潜力的同时，在检测开发和临床应用的推广方面也面对着一系列挑战。目前，血浆cfDNA的产生机制尚不明确。cfDNA多以DNA和蛋白质结合的复合物形式存在，仅极少数为游离的DNA片段。cfDNA在血浆和血清中都有存在，健康人外周血中cfDNA浓度大都小于100 ng/ml，平均值约为30 ng/ml。而在肿瘤患者体内，外周血cfDNA浓度可高达到1 000 ng/ml，平均值约为180 ng/ml。在其他的一些疾病，包括术后、寄生虫病、心血管疾病等也可见cfDNA水平的升高。
目前普遍认为细胞发生凋亡或者坏死释放的DNA片段是cfDNA的主要来源，但是不同疾病发生的病理生理进程不同，致病机制和疾病微环境也不同，因此不同疾病导致产生cfDNA的过程极为复杂，单一机制不能充分的阐明cfDNA产生的来源，往往是同时存在这两种产生机制。
cfDNA的主要作用：
胎儿的DNA会游离到孕妇的血液中，怀男孩的孕妇血液可以检测到Y染色体，还可用于产前检测，21和18三体；
器官移植免疫排斥产生的细胞死亡，DNA会释放到血液中，因此用于器官移植状态的监控；
cfDNA浓度与外伤、烧伤的损伤水平有关；
高浓度cfDNA也用于ICU死亡的预测，也可用于预测脓毒症和脓毒性休克，无菌性炎症，心肌梗死和无影像学结果的中风患者患病情况；
肿瘤来源的cfDNA，可以发现肿瘤相关的突变、杂合子缺失（LOH）、基因扩增、癌病毒DNA、抑癌基因启动子区的超甲基化，因此可以实现在无创条件下研究肿瘤DNA；
核小体在TSS区是否占据，影响cfDNA的深度，因此可以用来推测基因的表达情况；
目前cfDNA检验应用于临床常规的瓶颈主要集中于方法学和样本的质量上，由于血浆中存在的靶cfDNA微乎其微，标本的采集、抗凝剂使用和保存的不当都会影响检测的质量，造成假阳性或假阴性的结果。随着cfDNA分析技术迅速发展，在肿瘤学中具有许多有希望的临床应用。如果要实现cfDNA分析的有效临床整合，需要仔细了解这种方法的优点和局限性，以正确解释结果，用于指导临床决策。
柱式法提取步骤（参考）
1.转移 30µl Proteinase K 至 2.0ml 离心管中。
2.转移 0.6ml 血浆或其它液体样品至装有 Proteinase K 离心管中。
3.加入 0.6ml Buffer ACL 和(可选)5µl Carrier RNA 至样品中，涡旋混匀 15 秒。60℃水浴
4.加入 0.3ml 异丙醇至样品中，涡旋混匀 15 秒。室温放置 3 分钟。
5.把 HiPure Viral Mini Column 装在 2ml 收集管中。转移一半体积(750µl)混合液至柱子中。
6.倒弃滤液，把柱子装回收集管中。转移剩余混合液至柱子中。13,000 x g 离心 1 分
7.把柱子装在新的收集管中。加入 500µl Buffer GW1(已用乙醇稀释)至柱子上。13,000
8.倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入 500µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。
9.倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入 500µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。
10. 倒弃滤液，把柱子装回收集管中。13,000 × g 离心 2 分钟。
11. 将柱子装在新的 1.5ml 离心管中。60℃进一步干燥柱子 5 分钟。
12. 将柱子装在新的 1.5ml 离心管中。加入 30~50µl Buffer AE 或灭菌水至柱子的膜中央。
放置 3 分钟，13,000 × g 离心 1 分钟。
13. 丢弃 DNA 结合柱，把 DNA 保存于 2~8℃，长期保存需保存于-20℃。
磁珠法提取步骤（参考）
1. 在2.0ml离心管中，加入30µl Proteinase K和525µl MagIso Beads.
2. 转移600µl血浆至含蛋白酶K的离心管中。振荡混匀5秒。
3. 加入900µl Buffer ML至样品中，涡旋混匀15秒。室温或至55度放置10分钟，其间颠倒混匀次数。
4. 转移至磁力架上，静置3~5分钟吸附磁珠。小心吸弃所有溶液。
5. 加入600ul Buffer MW1，涡旋混匀15秒。
6. 转移至磁力架上，静置2分钟吸附磁珠。小心吸弃所有溶液。
7. 加入600ul 75%乙醇，涡旋混匀15秒。
8. 转移至磁力架上，静置2分钟吸附磁珠。小心吸弃所有溶液。
9. 重复第7-8步一次。
10. 空气干燥7~10分钟。
11. 加30~50µl 预热至55oC的Elution Buffer或灭菌水等缓冲液，涡旋打散磁珠。静置3~5分钟，其间轻轻振荡1~2次加速DNA溶解。
12. 转移至磁力架上，静置3分钟。转移DNA溶液至新的1.5ml离心管中。
| 货号 |
试剂名称-(GBCBIO) |
| D3206 |
无细胞游离DNA提取试剂盒 |
| M2105 |
磁珠法游离DNA提取试剂盒 |
1.Snyder M W, Kircher M, Hill A J, et al. Cell-free DNA comprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin[J]. Cell, 2016, 164(1-2):57.
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