3种常用化学发光法简介

化学发光免疫分析方法创建于1977年，由Halmann等人在放射免疫分析和酶免疫实验理论的基本上，将免疫反应的高特异性与化学发光的高灵敏性结合起来，建立的一种用于检测微量抗原、抗体、激素、酶等的新型免疫学分析方法。化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体，回到稳定的基态时，同时发射出光子,这就是化学发光的原理。固相载体分为板式分离和磁珠分离，板式分离可选择不透明的白色平板，以减少光管道和串扰，但现在大多选择了磁微粒（超顺磁珠），较板式分离扩大抗原抗体结合表面积，增加抗原或抗体的结合量，提高检测灵敏度，加快反应速度，迅速捕获抗原抗体。易于结合相、游离相的分离，提高检测准确性

直接化学发光法

图源：雨后彩虹落叶飞

酶促化学发光

酶促化学发光免疫分析主要是将酶标记在抗原、抗体、配体或受体上进行免疫反应，随后免疫复合物上的酶作用于发光底物产生发光，最终通过发光信号测定仪进行测定。化学发光的强度由酶的浓度决定。辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）是常用的标记酶，而鲁米诺和AMPPD则是代表性的发光底物。

鲁米诺是一种强效的化学发光物质，通常在中性溶液中以偶极离子（两性离子）形式存在。在碱性溶液中，它转变为二价负离子，并可被氧分子氧化为能产生化学发光的中间体。在氧化剂的作用下，鲁米诺被转化为激发态，随后激发态衰变回基态并发出荧光。鲁米诺发光的原理与羰基化合物的亲核加成相关，产生的荧光为蓝光，波长为425nm左右。这类化合物的发光特性为辉光型，发光时间可持续30~60min，启动发光反应后约2min发光强度达到最大。因此反应时间较长。由于底物在没有酶的情况下也有一定的发光因此一般本底较高；酶促反应可以放大发光过程，酶促化学发光一般灵敏度较高（样本的阴阳性分的较开）；酶促化学发光对酶的纯度和工艺较高，标记物成本会略高；酶分子量较大，可能引起免疫反应导致产生抗体，需要警惕酶分子引起的假阳性。

优势：发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，发光信号强而稳定，且发光时间较长；检测方式简单、成本较低。

劣势：相较直接化学发光，速度较慢，酶的活性和发光底物工作液容易受外界环境的影响,需要频繁定标。

图源：雨后彩虹落叶飞

电化学发光法

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