核酸标准品选择
上一期我们讲了核酸电泳如何选择琼脂糖和丙烯酰胺凝胶，这一期我们接着讲核酸电泳的样品和标准品准备过程中应该注意的一些点。
当运行凝胶时，含有已知大小的核酸参照样品通常被称为标准品、标记或 分子量标准，用于目的样品大小的估计。在为给定样品选择合适的分子量标准时，需考虑如下因素:
-
Ladde 类型(例如DNA或RNA)，片段结构(例如单链或双链)，构象(例如超螺旋、开环或线性）以确保对迁移进行适当比较(了解更多: 结构和构象对样品迁移性的影响） -
片段的数量和适当的分离形式，用于大小的估计 -
预期用途，如分子量标准是设计用于定性分析还是精确的 定量测定 -
不同类型凝胶适用的分子量标准(例如，部分预制凝胶推荐设计 特定分子量标准以获得最佳运行结果) -
上样染料的性质，避免目的条带 模糊(图6) -
上样缓冲液与使用凝胶的兼容性(例如，缓冲液的盐浓度会影响样品的迁移)
早期，DNA的大小标准主要来源于病毒基因组片段(例如,λφX174)和细菌质粒(如pUC19)的限制内切。该标准物在内切、样品纯度和电泳中带型的重现性方面存在问题。而后，从连接反应和/或PCR中获取的含有片段的分子量标准，因具有再现性且可产生预期大小的片段，而备受青睐。如今，因为色谱纯化片段实现了质量、带型、强度和数量等方面的更高控制，被视为分子量标准黄金标准(图6)。
此外，还设计出 室温下稳定、适合运输和储存，以及方便和少环境影响的分子量标准。而预混合，即用型分子量标准也 可供选择—添加了最佳浓度、可直接上样到凝胶的上样染料的分子量标准。
注意，由不同制造商生产、描述相同(例如，1kb或100 bp)的分子量标准，包含DNA片段的数量、大小和密度可能会有所 不同(图7)。使用前，请参考制造商提供的指南和协议，获取分子量标准组成及其使用用途准确而详细的说明。
与DNA 分子量标准不同， RNA 分子量标准 通常与含有变性剂的上样缓冲液一同提供。变性剂可维持RNA的单链形式，确保样品 可预测的迁移 和分离结果。当运行RNA凝胶电泳时，应避免使用DNA分子量标准，因为双链分离，在变性条件下使用会导致非规则方式分离。
图 6.DNA 分子量标准差异。 分子量标准 #2由色谱纯化的DNA片段组成，存在于上佳的上样缓冲液中，可产生相等或预期强度的条带，并且不含有条带污点，无染色阴影。与此相反，分子量标准 #1采用较老技术制造，并存在于次优组分的缓冲液中。图源：Thermo
样品和标准品准备
须计算上样到凝胶中的DNA量，以确保目的条带良好分离，并用于可视化和检测。虽然用荧光染料足以检测1 - 100 ng/条带的DNA，但最小可检测量取决于 所用染料(了解更多: 核酸染色特性）[6]。注意，样品或标准品的超载会造成条带污点并遮盖附近条带，从而导致条带分辨不清，特别是片段大小相似时(图8A)。
图 8. 次优样品分离。(A) 负载影响条带分辨率。 (B) 上样量过低会导致条带扭曲。图源：Thermo
上样染料和缓冲液选择
制备凝胶电泳时，样品中添加了凝胶上样缓冲液 (通常是6X或10X的原液)。上样缓冲液包括如下组分:
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密度成分，如甘油或蔗糖，增加样品粘度，确保样品沉入孔中。 -
盐，如Tris-HCl，为样品创造良好的离子强度和pH值环境。高盐浓度的上样缓冲液会产生更大片或扭曲的条带以及污点。 -
金属螯合剂，如EDTA，可阻止样品中的核酸酶降解核酸。 -
染料 为监测样品的上样、电泳进展和pH值变化提供了颜色指示。部分上样缓冲液可能包含多个染料，以便有效跟踪样品中不同大小分子的迁移。
| 货号 | 产品名称 |
|---|---|
| G4550 | 6XDNA Loading Buffer 6XDNA上样缓冲液 Components |
通常，上样染料 都是带负电荷的小分子，因此迁移方向与核酸相同。其中有的显示pH值颜色，上样和运行时可作为样品的pH指示剂(图 9A)。常用染料包括溴酚蓝、二甲苯青,苯酚红,和橙色G。选择上样缓冲液时,需注意染料的表面迁移(s)(图 9B, 表 5 和 6)以避免遮盖目的核酸条带,特别是分子大小接近时(图9C)。染料遮盖会影响目的条带的分析和量化，导致结果不可靠。
图 9. (A)中性pH中染料颜色。(B)在TAE和TBE缓冲液中不同百分比琼脂糖里的染料迁移。(C)在可视化过程中染料阴影遮盖条带。 图源：Thermo
有时，上样缓冲液包含清洗剂或还原剂，如 SDS, 尿素和 甲酰胺，以用于变性。此类添加剂可破坏核酸分子内部和分子间的相互作用，促成线性或单链的分子构象。为获得最佳分离结果，应将样品和变性剂加入至上样染料中一同加热(图 10A)。对来源于酶反应的双链DNA电泳，可将SDS添加到上样缓冲液，以破坏蛋白质和核酸之间的相互作用，防止样品迁移性改变(图 10B)。
| 货号 | 产品名称 |
|---|---|
| 0227 | SDS 十二烷基硫酸钠 |
| 0568 | Urea 尿素 |
| 0568 | Formamide, Deionized 去离子甲酰胺 |
图 10. 热量、SDS对样品电泳的影响。(A) 在不加热处理的情况下，将含有RNA分子量标准的变性缓冲液加入凝胶中。 (B) 在有或无SDS的上样缓冲液中准备来源于限制性内切和连接反应的DNA样品。在凝胶上样前，加热SDS中的样品。 图源：Thermo
表 5. 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中，溴酚蓝和二甲苯青FF的表观分子大小[2]。
(A)TBE和TAE缓冲液中的琼脂糖凝胶
| 溴酚蓝 | 二甲苯青FF | |||
|---|---|---|---|---|
| 凝胶% | TBE | TAE | TBE | TAE |
| 0.5 | 750 bp | 1,150 bp | 13,000 bp | 16,700 bp |
| 0.6 | 540 bp | 850 bp | 8,820 bp | 11,600 bp |
| 0.7 | 410 bp | 660 bp | 6,400 bp | 8,500 bp |
| 0.8 | 320 bp | 530 bp | 4,830 bp | 6,500 bp |
| 0.9 | 260 bp | 440 bp | 3,770 bp | 5,140 bp |
| 1.0 | 220 bp | 370 bp | 3,030 bp | 4,160 bp |
| 1.2 | 160 bp | 275 bp | 2,070 bp | 2,890 bp |
| 1.5 | 110 bp | 190 bp | 1,300 bp | 1,840 bp |
| 2.0 | 65 bp | 120 bp | 710 bp | 1,040 bp |
| 3.0 | 30 bp | 60 bp | 300 bp | 460 bp |
| 4.0 | 18 bp | 40 bp | 170 bp | 260 bp |
| 5.0 | 12 bp | 27 bp | 105 bp | 165 bp |
| 货号 | 产品名称 |
|---|---|
| T2866 | 5X TBE Tris-硼酸-EDTA 缓冲液 |
| G4566 | 50XTAE Tris-乙酸-EDTA缓冲液 |
(B)变性和非变性缓冲液中的聚丙烯酰胺凝胶
| 丙烯酰胺: bis (19:1), 胶凝% | 溴酚蓝 | 二甲苯青FF |
|---|---|---|
| 变性凝胶 | ||
| 4.0 | 50碱基 | 230碱基 |
| 5.0 | 35碱基 | 130碱基 |
| 6.0 | 26碱基 | 105碱基 |
| 8.0 | 19碱基 | 75碱基 |
| 10.0 | 12碱基 | 55碱基 |
| 15.0 | 10碱基 | 40碱基 |
| 20.0 | 8碱基 | 28碱基 |
| 30.0 | 6碱基 | 20碱基 |
| 非变性凝胶 | ||
| 3.5 | 100 bp | 460 bp |
| 5.0 | 65 bp | 260 bp |
| 8.0 | 45 bp | 160 bp |
| 12.0 | 20 bp | 70 bp |
| 15.0 | 15 bp | 60 bp |
| 20.0 | 12 bp | 45 bp |
品牌优势
捷倍斯生物可以提供专业和完善的核酸分离纯化解决方案，有硅胶柱法、磁珠法与溶液直接法的核酸纯化产品，在二代测序的样品前处理方面有着专业的技术与积累，有完善的针对唾液、血液与血浆等样品的保存、运输与高通量核酸纯化等整套的解决方案。 在诊断试剂原料方面，捷倍斯生物可以提供生物染色剂、高端的表面活性剂、显色底物、生物缓冲剂以及酶制剂与其稳定剂等系列产品。
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