一，尿液DNA检测有什么优势？
相对于血液样本，尿液样本DNA的检测更有优势。主要体现在尿液样本采集更方便，不需要专业人员的操作；尿液样本可以算是真正意义上的无创检测；尿液样本体积大，可以满足各种检测的样本量要求；可以实现多个时间点的纵向取样等。尿液cfDNA来源于肾等泌尿系统中的器官上皮细胞脱落及少量的白细胞等，其在患者中的含量高于健康人群，所以是研究泌尿系统癌症如膀胱癌、肾癌的理想选择。
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虽然尿液样本存在这么多优势，但目前尿液DNA的检测以及成功应用却非常少。主要归因于以下几个方面：
尿液的成分比较复杂，尤其是DNA酶的活性比血液中更高，所以更容易造成cfDNA的降解；尿液中存在大量的微生物，容易导致尿液样本失效；
尿液样本cfDNA的半衰期是2.6-5.1个小时，cfDNA片段的降解程度更高；
与血液样本相比，尿液中cfDNA的长度更短，且存在多个峰值，我们不能照搬血样cfDNA的检测方法；
目前缺少标准化的尿液DNA样本的保存或者分析方法。所有这些都限制了尿液DNA的应用。
将尿液样本收集在无菌尿液样本容器中，并在3小时内进行及时处理。2500g离心10分钟，将上清液按照1-2mL的规格进行分装并保存在-80度备用。后续提取DNA时使用的试剂盒使用的尿液体积是2mL。
对收集完成后1小时内的尿液样本进行处理，向40mL尿液中加入0.8mL的0.5M的EDTA，并分装成10mL一份，随后1600g离心10分钟，并保存在-80度。使用试剂盒从10mL尿液中提取DNA。
尿液样本采集完成后立即置于冰上，在收集后一小时内加入0.5M的EDTA，并在4度条件下1500g离心10分钟，收集上清液后20000g再次离心10分钟，随后按照2mL的标准进行分装并保存在-80度。
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收集不同个体的尿液样本（个人尿量有差异，在22-90mL范围内）于含EDTA的无菌瓶中。样本在室温条件（20度左右）下2000g离心10分钟，离心完成后将上清液转移到新管中并保存在-80度。 尿液样本收集后尽快与EDTA和Tris-HCI（PH 7.5）混合，使两者的最终浓度为25mM和10mM，随后将尿液保存在DNA LoBind tubes中放置在-20度，使用干冰运输到目的地后保存在-80度。后续使用时先将尿液在37度条件下解冻后8000g离心5分钟去除细胞碎片。（除去细胞DNA的干扰提取到的是cfDNA）
捷倍斯生物 （GBCBIO®-D2205 Cell-free Circulating DNA Kit 无细胞游离DNA提取试剂盒) ----用于从血浆、全血、无细胞体液、病毒原液和感染病毒的组织中提取游离DNA的试剂盒。循环 DNA 是指游离在细胞外的DNA ,循环 DNA 片断一般在 1KB 以下。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提，也无需进行耗时的醇类沉淀。得到的循环 DNA 可直接用于定量 PCR，液相或固相芯片分析，杂交和 SNP 检测等分析
捷倍斯生物公司的唾液DNA提取试剂盒（GBCBIO®-D2305 Saliva DNA Kit）通过 GBC 吸附柱从唾液/尿液等液体样品中快速大量纯化高纯度的基因组 DNA。，简化了从唾液、相关体液中分离 DNA 的步骤。无需苯酚-氯仿抽提、无需分离白细胞。样品经蛋白酶直接消化后，转移至柱子中，DNA 特异性结合到硅胶柱上，让污染物流过。PCR 抑制物如二价阳离子和蛋白，可通过两步有效的洗涤步骤被完全去除，结合在离心柱上的纯 DNA 可用水或试剂盒中的缓冲液洗脱。该试剂盒允许操作者在 20 分钟内完成多个样品基因组 DNA 的提取。纯化的基因组 DNA 可直接应用于各种下游应用，如 PCR、限制性酶切、Southern 杂交等
六， 尿液DNA提取操作步骤
以下以250μl唾液操作为例，DNA含量低的样品可以适当增加样品量，但以下操作的Buffer BL 与无水乙醇的用量要相应增加。
1. 取250μl 唾液，加入到1.5ml离心管中。
2. 加入20μl Protease K(20mg/ml)和250μl Buffer BL，最高速度涡旋15秒充分混匀。如果需要得到无RNA的基因组DNA，每个样品加入5μl RNA酶（10mg/ml，需另购买，GBCBIO货号P3414）。
3. 65℃水浴10分钟。孵育过程中短暂涡旋管子一次。
4. 加入250μl无水乙醇（96-100%，室温）至裂解液中，涡旋混匀，最高速度涡旋20秒混匀。将柱子稍微离心以收集盖子上的液滴（可不离心）。
5. 把GBC吸附柱装在在2ml收集管中（已提供），将第4步得到的溶液全部转入柱中，
10,000×g离心1min，倒弃流出液重新套上收集管。
6. 加入500μl Buffer WB至柱子中，10,000×g离心30秒，弃去流出液。
注意：Buffer WB使用前须按要求用无水乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室
温。
7. 将GBC吸附柱重新套回2ml收集管中，加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，10,000×g离心30秒，倒弃流出液；
注意：DNA Wash Buffer使用前须要用无水乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室温。
8. 再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g离心30秒,弃去流出液；
9. 将GBC吸附柱重新套回2ml收集管中，最大转速（>13.000×g）离心空结合柱1min以干燥柱子的基质；这一步对下面的洗脱步骤至关重要。
10. 将柱子置于1.5ml灭菌离心管，加入30-80μl 65℃预热的TE或灭菌去离子水至柱子的膜中央。 室温静置于5min；
11. 室温下，离心(>13.000)1min，以洗脱DNA。保留含DNA的流出液。将DNA储于-20℃。
250μl的血液可得的预期DNA产量大约为4～12μg。
注意：为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2分钟，
1,2000rpm离心2分钟。洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。
七，尿液DNA提取有哪些常见问题？
如何防止尿液DNA降解？
尿液中的DNA降解速度很快,这成为其在个体识别中的应用的障碍。我们如何防止尿液DNA降解?
尿液中含有哪些促进DNA降解的物质？
尿液中含有尿素、尿酸、肌酸、矿物盐、激肽酶等多种物质,这些物质会促进DNA的降解。尿液中的细菌也会分解DNA。此外,尿液中的PCR抑制因子如β-人绒毛膜促性腺激素也会降低DNA提取效率。
降低温度能防止DNA降解吗?
多数研究采用低温保存尿液样本,以防止DNA降解。但是,低温也会使尿液中的结晶体沉淀,形成沙状物,这些沉淀物会干扰DNA的提取。因此,仅仅降温无法完全防止DNA的降解。
添加UTI抑制酶能提高DNA稳定性吗?
UTI(尿激酶抑制剂)是一种特异性抑制胰腺酶的药物,可用来防治胰腺炎等疾病。研究表明,在尿液样本中添加UTI,可以抑制蛋白酶对DNA的降解,从而提高DNA的稳定性。适量的UTI可使尿液中的DNA保持可检测状态更长时间。
Tris-EDTA能够提高DNA提取吗?
尿液中的Tris-EDTA可通过螯合钙、镁等阳离子,起到抗钙化的作用,减少尿酸盐和氧化钙的沉淀,避免其对DNA提取的干扰。此外,Tris-EDTA还可增加尿液pH值,抑制在酸性条件下形成的尿酸结晶。因此,适量的Tris-EDTA也可提高DNA的提取效率。
小批量处理是否也有利于DNA提取?
大量的尿液样本中含有更多的盐分,这会干扰DNA从尿液中提取出来。研究表明,将样本分为小批量处理,然后再汇聚DNA提取,可以提高DNA回收率,获得更完整的微生物组信息。
综上,为提高尿液DNA稳定性,可在样品收集后及时加入适量UTI,然后低温保存;提取DNA时将样本分割小批量处理,避免过量盐分的干扰,从而提高尿液中DNA的提取效率。
参考文献
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品牌优势
捷倍斯生物可以提供专业和完善的核酸分离纯化解决方案，有硅胶柱法、磁珠法与溶液直接法的核酸纯化产品，在二代测序的样品前处理方面有着专业的技术与积累，有完善的针对唾液、血液与血浆等样品的保存、运输与高通量核酸纯化等整套的解决方案。 在诊断试剂原料方面，捷倍斯生物可以提供生物染色剂、高端的表面活性剂、显色底物、生物缓冲剂以及酶制剂与其稳定剂等系列产品。
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