TMB显色实验原理
TMB 是一种常用的辣根过氧化物酶（HRP）底物。在酶联免疫吸附测定（ELISA）等实验中，当抗原或抗体与酶（HRP）结合形成酶结合物，加入 TMB 底物后，在 HRP 的催化作用下，TMB 被氧化，发生显色反应。TMB 本身无色，被 HRP 催化氧化后生成蓝色产物，加入硫酸等终止液后，蓝色会转变为黄色。通过酶标仪在特定波长（如 450nm 或 630nm）下测定吸光度值，吸光度值的大小与酶结合物的量（即抗原或抗体的量）成正比，从而可以对样品中的目标物质进行定性或定量分析。
图源：科学直说
TMB显色实验步骤（以常见Elisa为例）
1. 包被
将抗原或抗体稀释到适当浓度，一般用包被缓冲液（如碳酸盐缓冲液，pH 9.6）进行稀释。
每孔加入一定体积（通常为 100 μL）的抗原或抗体溶液到酶标板中，将酶标板密封后，置于 4℃冰箱过夜或 37℃孵育 2 - 3 小时，使抗原或抗体吸附在酶标板的孔壁上。
2. 封闭
弃去孔内液体，用洗涤缓冲液（如含吐温 - 20 的磷酸盐缓冲液，PBST）洗涤酶标板 3 - 5 次，每次浸泡 3 - 5 分钟，然后拍干。
每孔加入封闭液（如 5% 脱脂牛奶或 1% BSA 溶液），一般每孔 200 μL，37℃孵育 1 - 2 小时，以封闭酶标板上未被抗原或抗体占据的位点，减少非特异性吸附。
3. 加样
弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗涤酶标板 3 - 5 次，每次浸泡 3 - 5 分钟，然后拍干。
将待检测样品用样本稀释液进行适当稀释后，每孔加入 100 μL，同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照，37℃孵育 1 - 2 小时，使样品中的目标抗原或抗体与包被在酶标板上的抗体或抗原结合。
4. 加酶结合物
弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤酶标板 3 - 5 次，每次浸泡 3 - 5 分钟，然后拍干。
每孔加入 100 μL 适当稀释的酶（辣根过氧化物酶，HRP）标记的抗体或抗原，37℃孵育 1 - 2 小时，使酶结合物与结合在酶标板上的目标抗原或抗体结合。
5. 加 TMB 底物
弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤酶标板 3 - 5 次，每次浸泡 3 - 5 分钟，然后拍干。
每孔加入 100 μL TMB 底物溶液，室温避光反应 15 - 30 分钟，在 HRP 的催化作用下，TMB 被氧化，溶液逐渐变为蓝色。
6. 终止反应
每孔加入 50 μL 终止液（一般为 2M 硫酸），此时溶液由蓝色变为黄色。注意硫酸具有强腐蚀性
| 货号 | 产品名称 |
|---|---|
| G1108 | TMB显色终止液(450nm, 不含硫酸) Stop Solution For TMB Substrate(450nm) |
| G1118 | TMB显色终止液(650nm, 无腐蚀性)Stop Solution For TMB Substrate(650nm) |
| G4308 | TMB Substrate For Blotting TMB显色试剂盒(组化或膜HRP显色用) |
| G4308 | TMB Substrate For Elisa TMB显色试剂盒（ELISA HRP显色用） |
| 0759 | TMB 四甲基联苯胺 |
产品介绍:
https://www.gbcbio.cn/Product/G1108.html
https://www.gbcbio.cn/Product/G1118-100ml.html
https://www.gbcbio.cn/Product/G4308.html
7. 测定吸光度
-
用酶标仪在特定波长（通常为 450nm）下测定各孔的吸光度值。
TMB显色注意事项
试剂方面
试剂保存：TMB 底物应避光保存于 2 - 8℃，避免反复冻融，使用前需恢复至室温。其他试剂如包被缓冲液、封闭液、洗涤缓冲液等也应按照规定条件保存，确保其有效性。
试剂配制：所有试剂应严格按照说明书进行配制，使用高质量的蒸馏水或去离子水，确保试剂的浓度和 pH 值准确。
试剂有效期：使用前检查试剂的有效期，过期试剂可能会影响实验结果。
操作方面
加样准确性：加样时应使用校准过的移液器，确保加样量准确，避免产生气泡，加样过程中要避免交叉污染。
洗涤充分性：洗涤步骤是减少非特异性信号的关键，要确保洗涤次数和时间足够，每次洗涤后要彻底拍干酶标板，避免残留的洗涤液影响后续反应。
孵育条件：孵育温度和时间应严格按照实验要求进行控制，孵育过程中要保持酶标板的密封性，避免水分蒸发和温度不均匀。
避光操作：TMB 底物对光敏感，在加底物和反应过程中应避免光照，可将酶标板放在暗盒或用铝箔纸包裹。
仪器方面
酶标仪校准：使用前要对酶标仪进行校准，确保波长准确性和吸光度测量的精度。
仪器清洁：定期清洁酶标仪的比色池，避免残留物质影响测量结果。
背景颜色过深：可能是由于洗板不充分，残留的酶结合物与底物反应产生颜色；也可能是封闭不彻底，导致非特异性吸附的蛋白质与酶结合物结合；此外，底物孵育时间过长、TMB 底物浓度过高或者酶结合物浓度过高也会造成背景颜色过深。
显色过浅或无显色：可能是样品中目标物质含量低，与酶结合物结合的量少；也可能是酶结合物失活，如保存不当、使用过期的酶结合物等；另外，孵育温度过低、时间过短，或者底物变质、加样量不准确等都可能导致显色过浅或无显色。
孔间差异大：可能是加样不准确，如加样量不一致、加样时产生气泡等；也可能是洗板不均匀，导致各孔之间残留的酶结合物量不同；此外，孵育时各孔的温度、湿度不一致，或者酶标板在孵育过程中受到震动等也会引起孔间差异。
显色不稳定：可能是底物的质量问题，如底物保存不当、过期等；也可能是实验环境温度、湿度变化较大，影响了酶促反应的稳定性；另外，实验操作过程中如移液速度、力度不均匀等也可能导致显色不稳定。
还没有开始显色反应，TMB就是浅蓝色了：TMB的保存要求低温避光，现用现配，环境中就有氧化物存在，如果TMB时间太长了，反复开封，不避光，温度高等，都可能发生氧化，变成有一点蓝。或者在反复使用的时候，试剂被污染，比如双氧水，漂白剂，实验室清洁剂，或者任何含有过氧化物酶的蛋白或者物体，都是有可能催化它的氧化的。过氧化物酶在生物体中广泛存在，血液、手汗等等。
TMB显色后，蓝色迅速消失：通常为显色系统内有还原物导致的，比如水、显色buffer、或试剂组分里面的其他物质。商业TMB里面为了在效期内保持无色，通常也加稳定剂，这个稳定剂也有可能是还原剂。比如常用的硫代硫酸盐。
TMB显色颜色和实验要求不一致：正常TMB+催化剂+双氧水是蓝色，但是变成了褐色或者棕色，通常是因为过渡氧化造成的，同时在建立显色系统的时候，要对pH、缓冲液浓度、HRP浓度、双氧水浓度等都要合理范围内。变成黑色和绿色。通常因为底物浓度太高，导致颜色过于集中，会显示深蓝色，看起来像是黑色。当pH发生变化的时候，颜色也会变化，加酸颜色变浅，从蓝色到绿色到黄色。
TMB 显色实验的原理基于酶催化底物显色，而在实验过程中可能会遇到背景颜色过深、显色过浅或无显色、孔间差异大、显色不稳定等常见问题，需要通过优化实验条件、规范实验操作等方法来解决。
声明：部分图源网络，侵权联删整合了网上诸多资料，因此未能一一注明出处。如有侵权，请联系作者删除。如需转载此文章请注明出处。
品牌优势
捷倍斯生物可以提供专业和完善的核酸分离纯化解决方案，有硅胶柱法、磁珠法与溶液直接法的核酸纯化产品，在二代测序的样品前处理方面有着专业的技术与积累，有完善的针对唾液、血液与血浆等样品的保存、运输与高通量核酸纯化等整套的解决方案。 在诊断试剂原料方面，捷倍斯生物可以提供生物染色剂、高端的表面活性剂、显色底物、生物缓冲剂以及酶制剂与其稳定剂等系列产品。
做值交往的人｜做值得信赖的产品
