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6种昆虫DNA提取方法及注意事项

6种昆虫DNA提取方法及注意事项 捷倍斯生物
2025-06-20
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导读:昆虫种类繁多,世界上已记录的昆虫有100多万种(其中有害昆虫八万余种),是目前最大的未被充分利用的宝贵资源。昆虫是动物界中最大的一个类群,在所有生物种类中占比超过50%,它们的踪迹几乎遍布世界的每一个

昆虫种类繁多,世界上已记录的昆虫有100多万种(其中有害昆虫八万余种),是目前最大的未被充分利用的宝贵资源。昆虫是动物界中最大的一个类群,在所有生物种类中占比超过50%,它们的踪迹几乎遍布世界的每一个角落。

有研究认为昆虫最早起源于奥陶纪,现存的昆虫谱系大多起源于密稳纪,而昆虫主要的多样性分化则出现在白垩纪时代

蜻蜓的起源可以追溯到约3.2亿年前‌‌最早的蜻蜓化石在二叠纪

图源:六图网

一. 常见的昆虫有哪些?

对人类健康危害最大的昆虫——蚊

蚊子属于双翅目蚊科,世界上约有3000种。是一种具有刺吸式口器的纤小飞虫。通常雌蚊以血液作为食物,而雄蚊则吸食植物的汁液。吸血的雌蚊是登革热、疟疾、黄热病、丝虫病、日本脑炎等其他病原体的中间寄主。蚊子的分布极为广泛,除南极洲外各大洲皆有蚊子的分布。其中,以按蚊属、伊蚊属和库蚊属最为著名。

相关研究▕疟疾载体——达氏按蚊的基因组研究[2]

按蚊是最主要的疟疾传播载体,在美洲每年由按蚊引起的疟疾有数百万例。

对农业危害最大的昆虫——蝗虫

蝗虫属直翅目,全世界有超过10,000种,广泛分布于热带、温带的草地和沙漠地区。蝗虫主要包括飞蝗和土蝗。在我国飞蝗有东亚飞蝗、亚洲飞蝗和西藏飞蝗3种,其中东亚飞蝗在我国分布范围最广,危害最严重,是造成我国蝗灾的最主要飞蝗种类,主要危害禾本科植物。全世界常年发生蝗虫的面积达4,680万km2,全球1/8的人口经常受到蝗灾的袭扰。

相关研究▕ 基因组信息揭示蝗虫与飞行和植食性相关的基因家族扩张[3]

在目前已完成测序的昆虫基因组中,最大的为东亚飞蝗,别看它身材小巧,基因组却高达6.5Gb,是人类基因组的2倍。研究发现东亚飞蝗基因组中存在大量的重复序列(至少60%),且这些序列的丢失频率明显比其他昆虫少很多,这是造成其庞大基因组的主要原因。

最浪漫的昆虫——萤火虫

萤火虫属鞘翅目萤科,是一种小型甲虫。因其尾部能发出荧光,故名为萤火虫。全世界约2000种,分布于热带、亚热带和温带地区,我国较常见的有黑萤、姬红萤、窗胸萤等几种。

萤火虫可以利用荧光的闪烁节奏形成特定的闪光信号,主要用来吸引异性交尾,偶尔也起一定的警戒作用。这种行为与蟋蟀鸣叫,蝴蝶起舞等类似,都可归为求偶行为,因为场面过于浪漫,被人们赋予更多诗意。

相关研究▕ 比较基因组学研究揭示萤火虫荧光素酶基因的起源与进化[4]

对遗传学研究贡献最大的昆虫——果蝇

果蝇广泛地存在于全球温带及热带气候区,目前发现有至少1000种,在人类的栖息地内如果园,菜市场等地区内皆可见其踪迹。

果蝇只有四对染色体,数量少而且形状有明显差别;果蝇性状变异很多,比如眼睛的颜色、翅膀的形状等性状都有多种变异,这些特点对遗传学研究也有很大好处,是很常用的遗传学研究材料。

相关研究▕ 低覆盖长读测序法快速组装果蝇参考基因组[5]

最顽强的昆虫——蟑螂

蟑螂是属于蜚蠊目的昆虫,世界上约有6000种,主要分布在热带和亚热带地区。少数蟑螂会入侵人类家居,大部分则是生活在野外。家居最常见的蟑螂,大的有美洲蟑螂、澳洲蟑螂及短翅的斑蠊,身长约5.0cm;小的有德国蟑螂、日本姬蠊及亚洲蟑螂,体长约1.5cm,热带地区的蟑螂一般体型比较巨大。

相关研究▕美洲蟑螂基因组——揭示环境适应性的遗传学基础[6]
美洲大蠊是一种杂食性食腐动物。它生长速度快、繁殖能力强,而且具有组织再生能力,因而能够在城市环境中生存。美洲大蠊的摄食范围特别广,这也是它们适应多种食物来源的基础。美洲大蠊能通过一个非常复杂的解毒酶系统解毒,而这正是它们能抵抗各种化学毒素和病原体的主要原因。
二. 昆虫DNA提取方法有哪些?

 DNA 提取是分子生物学研究中的基础步骤,其方法根据昆虫种类、样本大小、保存状态及后续实验需求的不同而有所差异。以下是几种常见的昆虫 DNA 提取方法,从原理、操作步骤、优缺点等方面进行详细介绍:

酚 - 氯仿抽提法(经典方法)

原理: 利用酚、氯仿等有机溶剂破坏细胞膜,使蛋白质变性沉淀,DNA 溶解于水相,从而实现 DNA 与蛋白质的分离。

酚 - 氯仿抽提法操作步骤

样本处理:将昆虫样本(如成虫、幼虫)用无菌水或 70% 乙醇清洗,去除表面杂质,吸干水分。
破碎细胞:在液氮中研磨样本,或使用组织匀浆器、蛋白酶 K 消化(如 56℃孵育 1-2 小时)破碎细胞。
抽提:加入平衡酚(pH 8.0)、氯仿 - 异戊醇(24:1)混合液,振荡离心后,DNA 存在于上层水相。
沉淀 DNA:向上清液中加入异丙醇或乙醇,低温沉淀 DNA,离心后弃上清。
洗涤与溶解:用 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀,晾干后溶于 TE 缓冲液或超纯水中。

优点:提取的 DNA 纯度高,适用于各种昆虫样本,尤其适合大片段 DNA(如基因组 DNA)的提取,可用于 PCR、测序等多种下游实验。

缺点:操作步骤繁琐,耗时较长;需使用有毒有机溶剂(如酚、氯仿),对操作人员健康和环境有潜在危害;样本量少时 DNA 得率较低。

CTAB 法(十六烷基三甲基溴化铵法)

原理CTAB 是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(如 1.5 M NaCl)可溶,低盐溶液中(如 0.5 M NaCl)沉淀,从而分离 DNA 与其他杂质(如多糖、蛋白质)。

CTAB 法操作步骤

样本破碎:同酚 - 氯仿法,可结合液氮研磨或蛋白酶 K 消化。
CTAB 缓冲液处理:加入含 CTAB、EDTA、 Tris-HCl 等的缓冲液,65℃水浴保温 30-60 分钟,裂解细胞并释放 DNA。
抽提:用氯仿 - 异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质,离心后取上清。
沉淀与洗涤:加异丙醇沉淀 DNA,70% 乙醇洗涤,溶于 TE 缓冲液。
优点:能有效去除昆虫体内的多糖、多酚等杂质(尤其适用于富含多糖的昆虫组织),DNA 纯度较高;对样本保存状态要求较低,新鲜、冰冻或酒精保存的样本均可使用。
缺点:操作步骤较多,需要较高温度孵育;CTAB 在低温下易沉淀,需注意试剂温度控制;对于小样本(如微量昆虫组织),得率可能不稳定。

SDS 法(十二烷基硫酸钠法)

原理: SDS 是一种阴离子去污剂,能破坏细胞膜和核膜,使蛋白质变性,同时与蛋白质结合形成复合物;通过蛋白酶 K 消化蛋白质,再用酚 - 氯仿抽提去除蛋白质,最终沉淀 DNA。

SDS 法操作步骤

样本处理与破碎:清洗样本,研磨或匀浆破碎,加入含 SDS、蛋白酶 K 的缓冲液,55-60℃孵育至溶液澄清。
抽提:用酚 - 氯仿 - 异戊醇(25:24:1)抽提,离心后取上清。
沉淀与溶解:加乙醇沉淀 DNA,洗涤后溶于 TE 或水。
优点:操作相对简单,裂解效率高,适用于大多数昆虫样本;成本较低,试剂易获取。
缺点:SDS 可能抑制后续酶反应(如 PCR),需彻底洗涤去除;提取的 DNA 中可能残留蛋白质,纯度略低于酚 - 氯仿法。

硅胶膜吸附法(商业试剂盒法)

原理: 利用硅胶膜在高盐缓冲液中吸附 DNA,而蛋白质、多糖等杂质不吸附的特性,通过洗涤缓冲液去除杂质,最后用低盐缓冲液或水洗脱 DNA。

硅胶膜吸附法操作步骤

样本裂解:使用试剂盒提供的裂解液(含蛋白酶 K、SDS 等)破碎细胞,释放 DNA。
结合 DNA:向裂解液中加入高盐结合缓冲液,混合后转移至硅胶膜离心柱,离心使 DNA 吸附到膜上。
洗涤:用洗涤缓冲液(含乙醇)去除杂质,离心弃废液。
洗脱:用 TE 缓冲液或超纯水洗脱 DNA,收集滤液。
优点:操作简便,流程标准化,耗时短(通常 30 分钟 - 1 小时);无需使用有毒有机溶剂(部分试剂盒仅需乙醇),安全性高;DNA 纯度高,适用于自动化高通量提取,适合大量样本处理。
缺点:试剂盒成本较高;对样本量有一定限制(过小或过大样本可能影响得率);某些昆虫(如富含几丁质或色素的种类)可能需要额外预处理步骤。
捷倍斯生物(GBCBIO®-D1805)昆虫DNA提取试剂盒 Insect DNA Kit  采用独特的裂解液能够有效除去多糖多酚等,能够从昆虫、软体动物、节肢 动物、蛔虫等样品中提取DNA,保存在在醇类的样品也适用于本试剂盒的提取。一次操作可以 处理小于50mg组织,样品经裂解液消化,氯仿分离除去大部分的多糖多酚,再经GBC分离柱进 一步纯化,便可得到高纯度的DNA。所得的DNA可以用于PCR,Southern杂交,酶切消化等实 验

Chelex-100 法(快速提取法)

原理: Chelex-100 是一种螯合树脂,能结合金属离子(如 Mg²⁺),抑制 DNA 酶活性,同时在高温(95-100℃)下裂解细胞,释放 DNA,通过离心去除杂质,上清液中即含粗提 DNA。

Chelex-100 法操作步骤

样本处理:取少量昆虫组织(如单只幼虫、附肢),放入含 Chelex-100 溶液(2-5%)的离心管中。
裂解:100℃沸水浴 10-15 分钟,使细胞破裂,DNA 释放。
离心:高速离心(12000 rpm,5 分钟),取上清液即为 DNA 粗提物。
优点:操作极简便,无需抽提或沉淀步骤,15-20 分钟即可完成;无需有毒试剂,成本低;适合微量样本(如单只昆虫、幼虫蜕皮)的快速 DNA 提取,适用于 PCR 等简单下游实验。
缺点:DNA 纯度低,含蛋白质、RNA 等杂质,可能抑制复杂酶反应;提取的 DNA 片段较短,不适合需要大片段 DNA 的实验(如基因组测序)。

磁珠法(基于磁性纳米颗粒)

原理: 磁性纳米颗粒表面修饰官能团(如硅羟基),在高盐缓冲液中可与 DNA 通过氢键结合,在外加磁场作用下分离磁珠 - DNA 复合物,洗涤后用低盐缓冲液洗脱 DNA。

磁珠法操作步骤

样本裂解:使用裂解液(含蛋白酶 K)破碎细胞,释放 DNA。
结合 DNA:加入磁珠悬浮液,混合后 DNA 吸附到磁珠上。
磁分离与洗涤:通过磁场吸附磁珠,弃上清,用洗涤液去除杂质。
洗脱 DNA:用洗脱液(如水)解离 DNA 与磁珠,磁场分离后收集上清。
优点:自动化程度高,可配合核酸提取仪实现高通量操作;操作温和,DNA 损伤少;纯度高,得率稳定;无需离心,减少样本损失。
缺点:磁珠试剂成本较高;需要专用设备(如磁力架或提取仪),不适合实验室小规模手动操作。
捷倍斯生物(GBCBIO®-M1805) 磁珠法昆虫DNA提取试剂盒 MagIso Insect DNA Isolation Kit 是专门为华大制造、KingFisher, 达安、天隆等核酸提取仪设计的产品,适合于从各种昆虫样本提取核酸。试剂盒基于超顺磁性的磁性粒子纯化技术,可最大程度减少交叉污染的风险,提高检测的灵敏度和准确度。仪器运行时间只需50分钟。得到的DNA可直接用于定量PCR和二代测序等实验。

其他方法

玻璃奶法:利用玻璃珠在高盐条件下吸附 DNA,通过洗涤和洗脱获取 DNA,成本较低,但操作较繁琐,适用于小样本。
热碱法:用 NaOH 溶液裂解细胞,调节 pH 后沉淀 DNA,操作快速,但 DNA 纯度低,仅适用于简单 PCR 检测。

不同方法的选择与对比

方法 纯度 操作难度 成本 适用场景
酚 - 氯仿抽提法
质量基因组 DNA 提取,需大片段 DNA(如构建基因组文库、Southern blot)
CTAB 法
富含多糖 / 多酚的昆虫样本(如某些甲虫、鳞翅目幼虫),需去除杂质
SDS 法
常规 DNA 提取,适用于大多数昆虫,对纯度要求不极高的实验(如普通 PCR)
硅胶膜试剂盒法
高通量样本处理,自动化提取,下游实验对 DNA 纯度要求高(如测序、荧光定量 PCR)
Chelex-100 法
极低
快速检测(如物种鉴定、病原体筛查),微量样本或现场快速实验
磁珠法
自动化高通量提取,大规模分子生物学研究,配合提取仪使用
三. 昆虫DNA提取有哪些注意事项?

昆虫DNA取样有哪些注意事项?

昆虫发育阶段优先级选取,胚胎 > 新孵化的幼虫 > 早期的蛹 > 成虫;不推荐使用成虫,若仅有成虫样本,则需在成虫接近死亡时去除壳、四肢和翅膀;微小昆虫需混样时,建议送同一亲本的子代样本。

取鲜活样本置于冻存管中,液氮速冻 30min,储存在-80℃直至使用;由于昆虫体内的食物可能会造成污染,因此在液氮速冻之前进行适当饥饿处理 1-2天(体型较大昆虫可去除肠道或去除整个腹部)。

昆虫DNA样本保存有哪些注意事项?

新鲜样本或 - 80℃保存的样本 DNA 质量最佳;酒精(70%-95%)保存的样本需用无菌水漂洗去除酒精,避免抑制酶活性;长期保存的干燥样本可能 DNA 降解,需增加裂解时间
操作过程中使用无菌器材,戴手套,避免外源 DNA(如操作人员自身 DNA、环境微生物 DNA)污染。
:根据下游需求匹配选择实验方法,如 PCR 可使用 Chelex 法或试剂盒法,而构建基因文库必须用高纯度的酚 - 氯仿法或磁珠法。

通过选择合适的提取方法,可高效获取昆虫 DNA,为昆虫分类、种群遗传、基因表达等研究奠定基础。

昆虫的DNA提取纯度不高怎么办?

这是由于昆虫体内复杂化合物会导致提取的DNA不纯或难以获得高分子量DNA(如提取柱堵塞)。这些杂质可能是来自复眼其他身体部位的色素酚类化合物刚毛和鳞片等身体部位的杂质(如大黄蜂、飞蛾,蝴蝶等)、 脂质(如幼虫)、糖类(如蜜蜂蜜囊)以及活性酶和化学物质(如甲虫的防御腺体、蜜蜂和黄蜂的毒腺、肠道或肠道微生物等)。

建议选择特定的组织(如胸部肌肉组织),去除身体上常见的污染源(如复眼、腺体、蜜囊和肠道),或在不同的生命阶段(如幼虫、蛹等)取样,有助于克服昆虫高分子量 DNA 提取的难题。


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参考文献:

[1] MisofB, Liu S, Meusemann K, et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern ofinsect evolution.[J]. Science, 2014, 346(6210):763-767.

[2] Marinotti O, Cerqueira G C, Almeida L G P D,et al. The Genome of Anopheles darlingi,the main neotropical malaria vector[J]. Nucleic Acids Research, 2013,41(15):7387-400.

[3] Wang X, Fang X, Yang P, et al. The locustgenome provides insight into swarm formation and long-distance flight.[J].Nature Communications, 2014, 5(5):2957.

[4] Fallon T R, Lower SE, Chang C H, et al.Firefly genomes illuminate the origin and evolution of bioluminescence[J].bioRxiv, 2017: 237586.

[5] Solares E A, Chakraborty M, Miller D E, etal. Rapid low-cost assembly of the Drosophila melanogaster reference genomeusing low-coverage, long-read sequencing[J]. bioRxiv, 2018: 267401.

[6] Li S, Zhu S, Jia Q, et al. The genomic andfunctional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach[J].Nature communications, 2018, 9(1): 1008.

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