上一期我们介绍了微生物样本采样几种常见方法：4类环境DNA提取样本采集指南 这一期我们介绍6种微生物样本的保存方法。
微生物样本保存是指保持微生物菌株活力和遗传特征的技术。微生物在使用和传代过程中很容易受到污染、变异甚至死亡，往往会导致菌株退化。菌种保存的目的是保持菌种的活力，避免损失，防止外来微生物的污染，尽量减少或防止变异，保持菌种原有的活力和特性。菌种保存的基本原理是使微生物的生命活动进入半永久休眠状态，换句话说，就是将微生物的新陈代谢限制在最低范围内。
实验室常用的保存方法包括甘油保存法、斜面保存法、穿刺保存法、液体石蜡覆盖法、沙漠土壤保存法和冷冻干燥法。
1. 甘油保存法
这种方法适用于菌种 中长期保存，可保存 1 年以上。由于甘油本身很浓稠，难以计量，通常以 1:1 的比例与生理盐水混合，配制成最终浓度为 50%的甘油溶液。使用时，应按 50%甘油：1:1 菌液的比例与菌液混合，使甘油的最终浓度为 20%-30%，甘油浓度过高或过低都不利于菌种保存。将甘油菌种移至-80℃冰箱中长期冷冻。需要使用菌种时，将冷冻管放入 37°C 水浴中快速解冻，直至菌种完全融化，即可取出菌种进行实验。
这种方法适用范围广，操作简单，保存期长，菌种不易发生变异。
2. 斜面保存法
将菌种接种到合适的固体斜面培养基中。细菌充分生长后，将其转移到 4°C 的冰箱中保存。保存时间取决于微生物的类型。一般来说，霉菌、放线菌和孢子形成菌需要每 2-4 个月传代一次，酵母菌每两个月传代一次，细菌最好每月传代一次。需要使用菌种时，可以用接种环从斜面上取少量细菌进行接种。
这种方法的优点是操作简单，使用方便，不需要特殊设备，可以随时检查保存的菌种是否死亡、变异或被外来菌污染。缺点是保存期短，菌种易发生变异，因为培养基的理化性质不是严格恒定的，反复通过会改变微生物的新陈代谢，而且这种方法被外来菌污染的几率较高。
3. 刺穿保存法
准备一管半固体运送培养基，用接种针挑取菌种，从半固体培养基中心垂直刺入，直至接近试管底部，但不要刺穿，然后沿原穿刺线拔出接种针，放入 4℃冰箱保存。此法与斜面保存法一样，需要定期传代。
4. 液体石蜡覆盖保存法
这种方法是斜面保存法的辅助方法。将菌株接种到合适的固体斜面培养基中。细菌充分生长后，注入无菌液体石蜡覆盖整个斜面，然后直立保存在 4 ℃ 冰箱中。液体石蜡可以防止培养基中水分蒸发导致菌株死亡，还可以使菌株与空气隔离，降低菌株的代谢活性，延长保存时间。需要使用菌种时，可以用接种环从斜面上挑取少量菌种。
这种方法的优点是操作简单，不需要特殊设备，不需要经常传代，保存时间较长。缺点是储存时必须直立放置，占用空间较大。
5. 沙漠土壤保存法
将培养好的菌种与无菌的沙漠土壤混合，将细菌吸附在沙漠土壤载体上。干燥后转入 4°C 冰箱保存。使用菌种时，取出几粒沙子即可。
这种方法操作简单，菌种保存时间长。
6. 冷冻干燥法
将菌种冷冻，通过加压升华去除水分。这样可以减少细胞的生理活动，长期保持菌种的存活状态。需要使用菌种时，使用无菌水或培养基重悬细胞，然后将细胞悬浮液转移到固体培养基平板上进行培养。
这种方法适合菌体的长期保存，但相关设备和操作较其他保存方法复杂。
总结
菌种保存的方法很多，但原理大同小异。首先要选择优良纯种。使用微生物的孢子、芽孢和无性体；其次，创造低温、干燥、缺氧等条件，抑制微生物的代谢功能，使其生命活动降到最低水平或进入休眠状态，从而延长菌种的寿命，保存菌种的原形，防止变异。无论采用哪种保存方法，都要求菌种在保存过程中不死亡、不被外来细菌污染、不降解。
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