荧光技术在生物化学及分子生物学研究中应用主要包括以下几个方面：
-
物质的定性：不同的荧光物质有不同的激发光谱和发射光谱，因此可用荧光进行物质的鉴别。与吸收光谱法相比，荧光法具有更高的选择性。 -
定量测定：利用在较低浓度下荧光强度与样品浓度成正比这一关系可以定量分析样品中荧光组分的含量，常用于测定氨基酸、蛋白质、核酸的含量。 -
研究生物大分子的物理化学特性及其分子的结构和构象：荧光的激发光谱、发射光谱、量子产率和荧光寿命等参数不仅和分子内荧光发色基团的本身结构有关，而且还强烈地依赖于发色团周围的环境，即对周围环境十分敏感。利用此特点可通过测定上述有关荧光参数的变化来研究荧光发色团所在部位的微环境的特征及其变化。 利用荧光寿命、量子产率等参数可以研究生物大分子中的能量转移现象：通过该现象的研究，可以获得生物大分子内部的许多信息。
四 荧光可视化需要借助哪些设备？
荧光显微镜的一个基本原理是在荧光剂的帮助下对细胞成分进行高度特异性的可视化。这可以是一种荧光蛋白——例如 GFP——在基因上与感兴趣的蛋白质相关联。如果克隆是不可能的——例如在组织学样本中——使用免疫荧光染色等技术来可视化感兴趣的蛋白质。为此，使用了与不同荧光染料连接并直接或间接与适当目标结构结合的抗体。在荧光染料的帮助下，荧光显微镜不仅限于蛋白质，还可用于检测核酸、聚糖和其他结构。甚至可以使用特定应用的各种活细胞染料，这些染料允许使用细胞器选择性染色（例如 ER、线粒体、高尔基体）或功能测定（例如，例如活细胞追踪、标记、细胞增殖或活死细胞测定，其中荧光是读出方式。甚至可以检测到钙离子等非生物物质。
五 常见的荧光标记--免疫荧光
在大多数情况下，使用两种形式的抗体。第一个与目标蛋白结合，本身没有荧光标记（一抗）。但是与一抗结合的第二种抗体（二抗）特异性地携带荧光染料。这种方法称为间接免疫荧光，具有几个优点。一方面存在放大效应，因为不止一种二抗与一种一抗结合。另一方面，通常比用普通荧光染料标记的特异性一抗更容易找到二抗。下面，我们介绍常用的荧光染料。
六 荧光染料有哪些？
异硫氰酸荧光素 (FITC) 是一种有机荧光染料，可能是免疫荧光和流式细胞术中最常用的染料之一。它在 495/517 nm 处有一个激发/发射峰，并且可以借助其与蛋白质上的氨基、巯基、咪唑基、酪氨酰基或羰基结合的反应性异硫氰酸酯基团与不同的抗体偶联。FITC（是最早用于荧光显微术的染料之一，也是 Alexa Fluor®488 等其他荧光染料的前体。它的荧光活性是由于其大的共轭芳族电子系统，可被蓝色光激发 光谱。
尽管 FITC 和 TRITC 仍被广泛使用，但它们是相当弱的荧光染料，不推荐用于最先进的显微镜检查。
Alexa Fluor® 染料是一大类带负电荷的亲水性荧光染料，常用于荧光显微术。所有 Alexa Fluor® 染料都是不同碱性荧光物质的磺化形式，如荧光素、香豆素、花青或罗丹明（例如 Alexa Fluor®546、Alexa Fluor®633）。在它们的标签中提到了各自的激光激发波长。例如，最常用的染料之一 Alexa Fluor®488 的最大激发波长为 493 nm，允许使用标准 488 nm 激光进行激发，而 Alexa Fluor®488 的最大发射波长为 519 nm，它是一种荧光素衍生物和 具有与 FITC 相似的特性。然而，它显示出更好的稳定性、亮度和更低的 pH 敏感性。
图源：知乎徕卡显微系统
小鼠转基因胚胎，中间体，E10.5小鼠转基因胚胎的五个中间体：EpaxisMyf5 eGFP；对 GFP-Alexa 488 进行免疫染色；胚胎肌纤维用 Desmin-Cy3 染色，细胞核从上到下显示为 Hoechst 尺寸：3.5 mm (a), 800 µm (b)。礼貌：Aurélie Jory, Cellules Souches et Développement, Institut Pasteur, Paris, France 和 IGBMC, IGBMC 影像中心
小鼠成纤维细胞，绿色：F-Actin，FITC，红色：Tubulin，Cy5，蓝色：Nuclei，DAPI。
无需事先操作即可在 DNA 和 RNA 之间产生差异的染料是吖啶橙。它的最大激发/发射对在 DNA 结合状态下为 502 nm/525 nm，在 RNA 结合状态下变为 460 nm/650 nm。此外，它可以进入酸性区室，如阳离子染料质子化的溶酶体。在这种酸性环境中，吖啶橙被蓝色光谱中的光激发，而橙色区域的发射最强。它通常用于识别凋亡细胞，因为它们有很多被吞噬的酸性隔间
6.4 区室和细胞器染料
LysoTracker 是一组不同颜色的染料，用于染色溶酶体等酸性隔室。这些是与荧光团连接的可渗透膜的弱碱基。由于质子化，这些碱很可能对酸性区室具有亲和力（见表 1）。与溶酶体相当的隔室是酿酒酵母等真菌中的液泡。这种膜封闭空间也是酸性的。在荧光显微镜中观察它的一种方法是使用苯乙烯基染料，如 FM 4-64® 或 FM 5-95®。
图源：知乎徕卡显微系统
Pukinje细胞，三色标记的小鼠小脑皮质矢状切片。红色：anti-calbindin-D28k/Cy3，绿色：anti-GFAP/Cy5，蓝色：Hoechst 33258
还可以借助于对细胞中不同位置有偏好的蛋白质来染色感兴趣区域。 这种方法的一个例子是小麦胚芽凝集素(WGA)的使用，它与存在于质膜中的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖基特异结合。
6.5 离子成像染料
在神经元研究、基因活动或细胞运动的情况下，研究细胞的离子浓度是有意义的。钠、钙、氯或镁离子对许多不同的细胞事件有深远的影响。通常，离子可以在荧光标记的螯合剂的帮助下被捕获，这些螯合剂在与适当的离子结合时会改变它们的光谱特性。标记螯合剂的一个例子是钙指示剂 fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4 和 Calcium-Green。对于钠检测，通常使用 SBFI（钠结合苯并呋喃间苯二甲酸酯）或钠绿。PBFI（钾结合苯并呋喃间苯二甲酸酯）检测钾离子。
Alexa 488（绿色曲线）和Alexa 555（黄色曲线）的荧光发射曲线。两个发射光谱的重叠是显而易见的。红线表示 488 发射滤波器的带通。
表1-荧光染料 （数据源：知乎徕卡显微系统）
| 荧光染料产品 | Excitation | Emission |
| Indo-1, Ca saturated | 331 nm | 404 nm |
| Indo-1 Ca2+ | 346 nm | 404 nm |
| Cascade Blue BSA pH 7.0 | 401 nm | 419 nm |
| Cascade Blue | 398 nm | 420 nm |
| LysoTracker Blue | 373 nm | 421 nm |
| Alexa 405 | 401 nm | 421 nm |
| LysoSensor Blue pH 5.0 | 374 nm | 424 nm |
| LysoSensor Blue | 374 nm | 424 nm |
| DyLight 405 | 399 nm | 434 nm |
| DyLight 350 | 332 nm | 435 nm |
| BFP (Blue Fluorescent Protein) | 380 nm | 439 nm |
| Alexa 350 | 343 nm | 441 nm |
| 7-Amino-4-methylcoumarin pH 7.0 | 346 nm | 442 nm |
| Amino Coumarin | 345 nm | 442 nm |
| AMCA conjugate | 347 nm | 444 nm |
| Coumarin | 360 nm | 447 nm |
| 7-Hydroxy-4-methylcoumarin | 360 nm | 447 nm |
| 7-Hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0 | 361 nm | 448 nm |
| 6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0 | 358 nm | 450 nm |
| Hoechst 33342 | 352 nm | 455 nm |
| Pacific Blue | 404 nm | 455 nm |
| Hoechst 33258 | 352 nm | 455 nm |
| Hoechst 33258-DNA | 352 nm | 455 nm |
| Pacific Blue antibody conjugate pH 8.0 | 404 nm | 455 nm |
| PO-PRO-1 | 434 nm | 457 nm |
| PO-PRO-1-DNA | 435 nm | 457 nm |
| POPO-1 | 433 nm | 457 nm |
| POPO-1-DNA | 433 nm | 458 nm |
| DAPI-DNA | 359 nm | 461 nm |
| DAPI | 358 nm | 463 nm |
| Marina Blue | 362 nm | 464 nm |
| SYTOX Blue-DNA | 445 nm | 470 nm |
| CFP (Cyan Fluorescent Protein) | 434 nm | 474 nm |
| eCFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein) | 437 nm | 476 nm |
| 1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS) | 375 nm | 479 nm |
| Indo-1, Ca free | 346 nm | 479 nm |
| 1,8-ANS (1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid) | 375 nm | 480 nm |
| BO-PRO-1-DNA | 462 nm | 482 nm |
| BOPRO-1 | 462 nm | 482 nm |
| BOBO-1-DNA | 461 nm | 484 nm |
| SYTO 45-DNA | 451 nm | 486 nm |
| evoglow-Pp1 | 448 nm | 495 nm |
| evoglow-Bs1 | 448 nm | 496 nm |
| evoglow-Bs2 | 448 nm | 496 nm |
| Auramine O | 431 nm | 501 nm |
| DiO | 487 nm | 501 nm |
| LysoSensor Green pH 5.0 | 447 nm | 502 nm |
| Cy 2 | 489 nm | 503 nm |
| LysoSensor Green | 447 nm | 504 nm |
| Fura-2, high Ca | 336 nm | 504 nm |
| Fura-2 Ca2+sup> | 336 nm | 505 nm |
| SYTO 13-DNA | 488 nm | 506 nm |
| YO-PRO-1-DNA | 491 nm | 507 nm |
| YOYO-1-DNA | 491 nm | 509 nm |
| eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) | 488 nm | 509 nm |
| LysoTracker Green | 503 nm | 509 nm |
| GFP聽(S65T) | 489 nm | 509 nm |
| BODIPY FL, MeOH | 502 nm | 511 nm |
| Sapphire | 396 nm | 511 nm |
| BODIPY FL conjugate | 503 nm | 512 nm |
| MitoTracker Green | 490 nm | 512 nm |
| MitoTracker Green FM, MeOH | 490 nm | 512 nm |
| Fluorescein 0.1 M NaOH | 493 nm | 513 nm |
| Calcein pH 9.0 | 494 nm | 514 nm |
| Fluorescein pH 9.0 | 490 nm | 514 nm |
| Calcein | 493 nm | 514 nm |
| Fura-2, no Ca | 367 nm | 515 nm |
| Fluo-4 | 494 nm | 516 nm |
| FDA | 495 nm | 517 nm |
| DTAF | 495 nm | 517 nm |
| Fluorescein | 495 nm | 517 nm |
| Fluorescein antibody conjugate pH 8.0 | 493 nm | 517 nm |
| CFDA | 495 nm | 517 nm |
| FITC | 495 nm | 517 nm |
| Alexa Fluor 488 hydrazide-water | 493 nm | 518 nm |
| DyLight 488 | 493 nm | 518 nm |
| 5-FAM pH 9.0 | 492 nm | 518 nm |
| FITC聽antibody conjugate pH 8.0 | 495 nm | 519 nm |
| Alexa 488 | 493 nm | 520 nm |
| Rhodamine 110 | 497 nm | 520 nm |
| Rhodamine 110 pH 7.0 | 497 nm | 520 nm |
| Acridine Orange | 431 nm | 520 nm |
| Alexa Fluor 488 antibody conjugate pH 8.0 | 499 nm | 520 nm |
| BCECF pH 5.5 | 485 nm | 521 nm |
| PicoGreendsDNA quantitation reagent | 502 nm | 522 nm |
| SYBR Green I | 498 nm | 522 nm |
| Rhodaminen Green pH 7.0 | 497 nm | 523 nm |
| CyQUANT GR-DNA | 502 nm | 523 nm |
| NeuroTrace 500/525, green fluorescent Nissl stain-RNA | 497 nm | 524 nm |
| DansylCadaverine | 335 nm | 524 nm |
| Rhodol Green antibody conjugate pH 8.0 | 499 nm | 524 nm |
| Fluoro-Emerald | 495 nm | 524 nm |
| Nissl | 497 nm | 524 nm |
| Fluorescein dextran pH 8.0 | 501 nm | 524 nm |
| Rhodamine Green | 497 nm | 524 nm |
| 5-(and-6)-Carboxy-2', 7'-dichlorofluorescein pH 9.0 | 504 nm | 525 nm |
| DansylCadaverine, MeOH | 335 nm | 526 nm |
| eYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) | 514 nm | 526 nm |
| Oregon Green 488 | 498 nm | 526 nm |
| Oregon Green 488 antibody conjugate pH 8.0 | 498 nm | 526 nm |
| Fluo-3 | 506 nm | 527 nm |
| BCECF pH 9.0 | 501 nm | 527 nm |
| SBFI-Na+ | 336 nm | 527 nm |
| Fluo-3 Ca2+ | 506 nm | 527 nm |
| Rhodamine 123, MeOH | 507 nm | 529 nm |
| FlAsH | 509 nm | 529 nm |
| Calcium Green-1 Ca2+ | 506 nm | 529 nm |
| Magnesium Green | 507 nm | 530 nm |
| DM-NERF pH 4.0 | 493 nm | 530 nm |
| Calcium Green | 506 nm | 530 nm |
| Citrine | 515 nm | 530 nm |
| LysoSensor Yellow pH 9.0 | 335 nm | 530 nm |
| TO-PRO-1-DNA | 515 nm | 531 nm |
| Magnesium Green Mg2+ | 507 nm | 531 nm |
| Sodium Green Na+ | 507 nm | 531 nm |
| TOTO-1-DNA | 514 nm | 531 nm |
| Oregon Green 514 | 512 nm | 532 nm |
| Oregon Green 514 antibody conjugate pH 8.0 | 513 nm | 533 nm |
| NBD-X | 466 nm | 534 nm |
| DM-NERF pH 7.0 | 509 nm | 537 nm |
| NBD-X, MeOH | 467 nm | 538 nm |
| CI-NERF pH 6.0 | 513 nm | 538 nm |
| Alexa 430 | 431 nm | 540 nm |
| Alexa Fluor 430 antibody conjugate pH 7.2 | 431 nm | 540 nm |
| CI-NERF pH 2.5 | 504 nm | 541 nm |
| Lucifer Yellow, CH | 428 nm | 542 nm |
| LysoSensor Yellow pH 3.0 | 389 nm | 542 nm |
| 6-TET, SE pH 9.0 | 521 nm | 542 nm |
| Eosin antibody conjugate pH 8.0 | 525 nm | 546 nm |
| Eosin | 524 nm | 546 nm |
| 6-Carboxyrhodamine 6G pH 7.0 | 526 nm | 547 nm |
| 6-Carboxyrhodamine 6G, hydrochloride | 525 nm | 547 nm |
| Bodipy R6G SE | 528 nm | 547 nm |
| BODIPY R6G, MeOH | 528 nm | 547 nm |
| 6 JOE | 520 nm | 548 nm |
| Cascade Yellow antibody conjugate pH 8.0 | 399 nm | 549 nm |
| Cascade Yellow | 399 nm | 549 nm |
| mBanana | 540 nm | 553 nm |
| Alexa Fluor 532 antibody conjugate pH 7.2 | 528 nm | 553 nm |
| Alexa 532 | 528 nm | 553 nm |
| Erythrosin-5-isothiocyanate pH 9.0 | 533 nm | 554 nm |
| 6-HEX, SE pH 9.0 | 534 nm | 559 nm |
| mOrange | 548 nm | 562 nm |
| mHoneydew | 478 nm | 562 nm |
| Cy 3 | 549 nm | 562 nm |
| Rhodamine B | 543 nm | 565 nm |
| DiI | 551 nm | 565 nm |
| 5-TAMRA-MeOH | 543 nm | 567 nm |
| Alexa 555 | 553 nm | 568 nm |
| Alexa Fluor 555 antibody conjugate pH 7.2 | 553 nm | 568 nm |
| DyLight 549 | 555 nm | 569 nm |
| BODIPY TMR-X, SE | 544 nm | 570 nm |
| BODIPY TMR-X, MeOH | 544 nm | 570 nm |
| PO-PRO-3-DNA | 539 nm | 571 nm |
| PO-PRO-3 | 539 nm | 571 nm |
| Rhodamine | 551 nm | 573 nm |
| Bodipy TMR-X conjugate | 544 nm | 573 nm |
| POPO-3 | 533 nm | 573 nm |
| Alexa 546 | 562 nm | 573 nm |
| BODIPY TMR-X antibody conjugate pH 7.2 | 544 nm | 573 nm |
| Calcium Orange Ca2+ | 549 nm | 573 nm |
| TRITC | 550 nm | 573 nm |
| Calcium Orange | 549 nm | 574 nm |
| Rhodaminephalloidin pH 7.0 | 558 nm | 575 nm |
| MitoTracker Orange | 551 nm | 575 nm |
| MitoTracker Orange, MeOH | 551 nm | 575 nm |
| Phycoerythrin | 565 nm | 575 nm |
| Magnesium Orange | 550 nm | 575 nm |
| R-Phycoerythrin pH 7.5 | 565 nm | 576 nm |
| 5-TAMRA pH 7.0 | 553 nm | 576 nm |
| 5-TAMRA | 549 nm | 577 nm |
| Rhod-2 | 552 nm | 577 nm |
| FM 1-43 | 472 nm | 578 nm |
| Rhod-2 Ca2+ | 553 nm | 578 nm |
| Tetramethylrhodamine antibody conjugate pH 8.0 | 552 nm | 578 nm |
| FM 1-43 lipid | 473 nm | 579 nm |
| LOLO-1-DNA | 568 nm | 580 nm |
| dTomato | 554 nm | 581 nm |
| DsRed | 563 nm | 581 nm |
| Dapoxyl (2-aminoethyl) sulfonamide | 372 nm | 582 nm |
| Tetramethylrhodamine dextran pH 7.0 | 555 nm | 582 nm |
| Fluor-Ruby | 554 nm | 582 nm |
| Resorufin | 571 nm | 584 nm |
| Resorufin pH 9.0 | 571 nm | 584 nm |
| mTangerine | 568 nm | 585 nm |
| LysoTracker Red | 578 nm | 589 nm |
| Lissaminerhodamine | 572 nm | 590 nm |
| Cy 3.5 | 578 nm | 591 nm |
| Rhodamine Red-X antibody conjugate pH 8.0 | 573 nm | 591 nm |
| Sulforhodamine 101, EtOH | 578 nm | 593 nm |
| JC-1 pH 8.2 | 593 nm | 595 nm |
| JC-1 | 592 nm | 595 nm |
| mStrawberry | 575 nm | 596 nm |
| MitoTracker Red | 578 nm | 599 nm |
| MitoTracker Red, MeOH | 578 nm | 599 nm |
| X-Rhod-1 Ca2+ | 580 nm | 602 nm |
| Alexa Fluor 568 antibody conjugate pH 7.2 | 579 nm | 603 nm |
| Alexa 568 | 576 nm | 603 nm |
| 5-ROX pH 7.0 | 578 nm | 604 nm |
| 5-ROX (5-Carboxy-X-rhodamine, triethylammonium salt) | 578 nm | 604 nm |
| BO-PRO-3-DNA | 574 nm | 604 nm |
| BOPRO-3 | 574 nm | 604 nm |
| BOBO-3-DNA | 570 nm | 605 nm |
| Ethidium Bromide | 524 nm | 605 nm |
| ReAsH | 597 nm | 608 nm |
| Calcium Crimson | 589 nm | 608 nm |
| Calcium Crimson Ca2+ | 590 nm | 608 nm |
| mRFP | 585 nm | 608 nm |
| mCherry | 587 nm | 610 nm |
| Texas Red-X antibody conjugate pH 7.2 | 596 nm | 613 nm |
| HcRed | 590 nm | 614 nm |
| DyLight 594 | 592 nm | 616 nm |
| Ethidium homodimer-1-DNA | 528 nm | 617 nm |
| Ethidiumhomodimer | 528 nm | 617 nm |
| Propidium Iodide | 538 nm | 617 nm |
| SYPRO Ruby | 467 nm | 618 nm |
| Propidium Iodide-DNA | 538 nm | 619 nm |
| Alexa 594 | 590 nm | 619 nm |
| BODIPY TR-X, SE | 588 nm | 621 nm |
| BODIPY TR-X, MeOH | 588 nm | 621 nm |
| BODIPY TR-X phallacidin pH 7.0 | 590 nm | 621 nm |
| Alexa Fluor 610 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2 | 567 nm | 627 nm |
| YO-PRO-3-DNA | 613 nm | 629 nm |
| Di-8 ANEPPS | 469 nm | 630 nm |
| Di-8-ANEPPS-lipid | 469 nm | 631 nm |
| YOYO-3-DNA | 612 nm | 631 nm |
| Nile Red-lipid | 553 nm | 636 nm |
| Nile Red | 559 nm | 637 nm |
| DyLight 633 | 624 nm | 646 nm |
| mPlum | 587 nm | 649 nm |
| TO-PRO-3-DNA | 642 nm | 657 nm |
| DDAO pH 9.0 | 648 nm | 657 nm |
| Fura Red, high Ca | 434 nm | 659 nm |
| Allophycocyanin pH 7.5 | 651 nm | 660 nm |
| APC (allophycocyanin) | 650 nm | 660 nm |
| Nile Blue, EtOH | 631 nm | 660 nm |
| TOTO-3-DNA | 642 nm | 661 nm |
| Cy 5 | 646 nm | 664 nm |
| BODIPY 650/665-X, MeOH | 646 nm | 664 nm |
| Alexa Fluor 647 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2 | 569 nm | 666 nm |
| DyLight 649 | 652 nm | 668 nm |
| Alexa Fluor 647 antibody conjugate pH 7.2 | 653 nm | 668 nm |
| Alexa 647 | 653 nm | 669 nm |
| Fura Red Ca2+ | 435 nm | 670 nm |
| Atto 647 | 644 nm | 670 nm |
| Fura Red, low Ca | 472 nm | 673 nm |
| Carboxynaphthofluorescein pH 10.0 | 600 nm | 674 nm |
| Alexa 660 | 664 nm | 691 nm |
| Alexa Fluor 660 antibody conjugate pH 7.2 | 663 nm | 691 nm |
| Cy 5.5 | 673 nm | 692 nm |
| Alexa Fluor 680 antibody conjugate pH 7.2 | 679 nm | 702 nm |
| Alexa 680 | 679 nm | 703 nm |
| DyLight 680 | 678 nm | 706 nm |
| Alexa Fluor 700 antibody conjugate pH 7.2 | 696 nm | 719 nm |
| Alexa 700 | 696 nm | 720 nm |
| FM 4-64, 2% CHAPS | 506 nm | 751 nm |
| FM 4-64 | 508 nm | 751 nm |
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品牌优势
捷倍斯生物可以提供专业和完善的核酸分离纯化解决方案，有硅胶柱法、磁珠法与溶液直接法的核酸纯化产品，在二代测序的样品前处理方面有着专业的技术与积累，有完善的针对唾液、血液与血浆等样品的保存、运输与高通量核酸纯化等整套的解决方案。 在诊断试剂原料方面，捷倍斯生物可以提供生物染色剂、高端的表面活性剂、显色底物、生物缓冲剂以及酶制剂与其稳定剂等系列产品。
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