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八种核酸提取纯化方法及原理简介

八种核酸提取纯化方法及原理简介 捷倍斯生物
2024-07-05
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导读:现今并非所有的核酸检测方法都需要从原始样品中提取核酸,但如果不对核酸进行提取和纯化而采取直接检测,样品中的杂质可能会影响检测结果的准确性。例如,如果某病毒样品中存在过多的RNA酶等杂质,可能会使得病毒
什么是核酸? 





核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,为生命的最基本物质之一,分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。

核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸,其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。
DNA主要集中在细胞核内,线粒体和叶绿体中,而RNA主要分布在细胞质当中。

图源:百度百科


为什么要进行核酸提取? 





核酸分子的获取(核酸提取)是核酸分子检测必不可少的前处理步骤,而且从复杂的生物样本中分离出高纯度的核酸是确保高灵敏、高精确度检测的关键。


现今并非所有的核酸检测方法都需要从原始样品中提取核酸,但如果不对核酸进行提取和纯化而采取直接检测,样品中的杂质可能会影响检测结果的准确性。例如,如果某病毒样品中存在过多的RNA酶等杂质,可能会使得病毒RNA发生降解,而导致检测失败,此外,杂质还可能与检测试剂发生非特异性反应,干扰检测过程,降低检测敏感度等问题,甚至可能造成假阳性或假阴性结果。因此,为了实现目标物的精准检测,核酸提取是至关重要的实验步骤。


核酸提取纯化方法及原理 





核酸提取包括裂解分离纯化两个过程。核酸是复杂的生物大分子,通常位于细胞核内,并与各种蛋白质结合在一起。为了获得高质量的核酸分子,需要将细胞进行裂解以释放核酸分子(裂解),并需要利用核酸与蛋白质等其他分子理化性质的差异,从混杂的溶液中将核酸分子分离出来(分离纯化)
同时,为了便于后续的研究,需尽可能保证核酸分子一级结构的完整性,并避免蛋白质、脂类物质和多糖等生物大分子的污染。

图源:健康守望角

3种裂解方法


核酸提取的第一步是样品裂解,释放核酸,该过程目的主要是将细胞或病毒中的核酸分子与其它生物大分子,如蛋白质,脂质,多糖链等,从细胞中释放。主要通过机械破坏化学作用酶催化反应三种方法的一种或组合实现,这三种方法的

对比如下表所示。


图源:健康守望角
基因组DNA常用裂解方法:
CTAB:CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂,高离子浓度与蛋白质和多聚糖形成复合物,而不沉淀核酸。
SDS法:SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子去垢剂,高温(55-60℃)裂解细胞,蛋白变性,染色体离析,在高盐环境下或降低温度后蛋白等结合形成的复合物沉淀,释放核酸。

图源:健康守望角

质粒DNA常用裂解方法

碱裂解-SDS法:在氢氧化钠(pH12.0-12.6碱性环境)和去污剂SDS的作用下细胞破裂,细菌蛋白质和染色体DNA变性,双链DNA氢键断裂,DNA变性。加入酸性高盐缓冲液后H恢复中性,共价闭合环状质粒DNA复性速度快于线性的染色体DNA。细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物被SDS包盖。之后复合物沉淀下来,质粒DNA留在上清中。

图源:健康守望角

煮沸法:含有Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中加热至100℃使细菌裂解。通过加热破坏细菌外壁的同时有助于解开DNA链的碱基配对,并使蛋白质和染色体DNA变性。温度下降后,闭环DNA形成超螺旋分子,离心时留在上清中

图源:健康守望角


5种纯化方法


通过裂解之后的样品往往包含多种物质,为了得到不含杂质的核酸,还需要进行纯化处理,常见的纯化方法主要有酚氯仿法盐析法玻璃珠法离心柱法磁珠法等,方法对比如下表。

图源:健康守望角

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