一.什么是FFPE样本？
FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded，福尔马林固定石蜡包埋) 样本是将细胞、组织等放到固定液中，将固定后的细胞、组织置入由液体石蜡填充的容器中进行保存的样本，这样处理能够较长时间地保持细胞病理的原始状态。
二. FFPE应用在哪些方面？
这项技术长期以来在临床检验、医学科学研究中得到广泛应用，尤其是细胞形态学研究和肿瘤病理学研究，如：HE染色、免疫组化及荧光原位杂交等。随着分子生物学的发展，FFPE样本在分子诊断及研究的应用需求越来越多。目前在NGS医检所中，除去血液样本，接收的所有组织样本几乎均为蜡块、白片、蜡卷等FFPE样本。为了保证NGS实验数据的准确性与真实性，从FFPE样本中纯化出高质量的核酸十分重要。
三.FFPE样本制备及核酸提取流程
图源：absin
四.FFPE样本核酸质量因素有些？
一般核酸提取纯化有三个质检指标：核酸浓度、核酸纯度及核酸完整度，而FFPE样本由于福尔马林处理，损伤核酸，影响下游应用数据的真实性，提高了核酸提取难度。
图源：迪赢生物
一般来说FFPE 样本可以保存长达数年时间，但超过一年的FFPE样本不建议用于NGS实验。即使在一年内，随着保存时间的增加，DNA的片段化也会加剧，因此应用于NGS检测的FFPE样本应该在采样后尽快完成实验。
五.FFPE样本制备及核酸纯化怎么做？
要想从FFPE样本中提取纯化出高质量的核酸，首先需要得到高质量的FFPE样本，从FFPE样本的制备到核酸的提取，我们需要注意以下几点。
1、FFPE样本选择采集
快速从病人身上获取组织样本。为避免组织离体后在外界环境中可能发生基因改变、组织自溶等变化，组织从获取到固定之间的时间间隔控制得越短越好。
FFPE可以采用新鲜组织样本或细胞样本进行制备。对于肿瘤病理组织样本而言，目的是研究肿瘤细胞，因此在活检或手术取组织样本时肿瘤组织的占比一般要大于20%以上，并在取样后要用生理盐水冲洗，避免血液中gDNA污染。周围炎症严重的肿瘤细胞、黏液产生过多的肿瘤细胞、病变中心广泛纤维化的肿瘤细胞不能采集，以免产生假阴性结果。手术采样的肿块组织不低于50mg，穿刺采样应≥2条，长度≥0.5 cm。
2、FFPE样本组织固定
将获得的组织置于一定浓度（一般是10%）的福尔马林溶液中。福尔马林的作用是用于组织固定，这个过程会使蛋白质之间、核酸之间、蛋白质和核酸之间发生一定程度的交联。此过程要注意把握组织的厚度，固定的时间。
a.组织新鲜。务必在组织离体后30min内浸入适量组织固定液中进行固定。
b.适当的固定液。液体与组织大小比例为10:1，应当使用中性的福尔马林缓冲溶液，避免使用酸性及含有重金属离子的固定液，目前市面上有使用多聚甲醛代替。
c.适当的固定时间。时间较短可能导致标本较深处组织未渗入福尔马林，而发生核酸和蛋白降解。固定时间过长则导致更密集的交联，让核酸和蛋白的提取变得更加困难。体积较大的标本应充分固定至6-48h，但不超过72h，小活检标本固定6-12h即可。
图源：迪赢生物
新鲜组织放入RNA保护液作为对照组，福尔马林分别固定20h和72h并进行石蜡包埋作为实验组，利用Agilent® 2100 Bioanalyzer分析。并使用一步法RT-PCR验证。扩增子大小如图所示，RT-PCR的结果以颜色显示：红色表示无扩增，黄色表示弱的扩增，绿色表示成功的扩增。尽管较长时间的固定对RNA片段化和核糖体条带影响甚微，但较长扩增子的扩增效率差。推测由于RNA分子的过度交联和较高比例的不可逆交联导致。
d.合适的组织大小。福尔马林大约以1 mm/小时的速率渗透组织，通常建议固定最多5 mm厚的组织标本。
样品厚度对RNA完整性的影响
图源：迪赢生物
将大鼠的肾与脑组织整个器官（whole）与≤4 mm的器官切片（cut）分别进行福尔马林固定和石蜡包埋。左图包埋后3天纯化RNA，并利用Agilent® 2100 Bioanalyzer分析。在整个脑组织（whole Brain）的电泳峰图中，双箭头指出了18S rRNA和28S rRNA的峰减少，表明RNA片段化的增加。右图纯化的RNA被用于一步法RT-PCR中，从左到右，扩增子大小分别为96nt、206nt、400nt、613nt和785nt。从图可以看出较大片段的RNA存在降解。
3、石蜡包埋切片
将组织用石蜡进行包埋。此过程包含：
1）脱水，使用醇类替换水；
2）透明，使用二甲苯替换掉醇类；
3）浸蜡，将组织浸入石蜡中，利用石蜡替换掉二甲苯；
4）包埋，将渗透后的组织样本浸泡在液态石蜡中，连同包埋模具一起冰冷后固化，再切割为薄片后成为固定石蜡样本，可长期保存或进行下游实验。
4、核酸提取纯化
核酸的提取有多种成熟的方法，包括酚氯仿抽提法、柱膜法、磁珠法等等，各方法在提取FFPE样本核酸时没有太大差异，只需要根据自己的实验需要选择即可。
图源：absin
脱蜡
用手术刀片刮取玻片上的样本至取样管中，加入去蜡剂或二甲苯，在一定温度中孵育进行脱蜡暴露组织。
因为FFPE样本的特殊性，石蜡会阻碍消化液对组织的渗透，抑制蛋白酶K对组织内蛋白质的消化，从而影响核酸的释放。为消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，对组织进行彻底的脱蜡十分重要。传统的脱蜡方式为二甲苯脱蜡，二甲苯脱蜡不仅容易造成核酸片段化和得率低，而且对人有毒害，切片越厚或存放时间越长，脱蜡效果越差。目前市面上主流方案是采用无毒脱蜡液，以及Covaris的超声乳化脱蜡。
组织消化
为了将DNA与结合的蛋白质分离，FFPE样本需经受高温和蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白质组分以及样品中可能存在的任何核酸酶，这个步骤还可防止DNA发生降解。对消化时间进行优化十分重要。消化的时间过短，DNA的释放不充分，导致核酸提取的得率低。消化时间可以根据组织类型、组织大小进行调节，使DNA充分释放。
裂解-解交联
利用裂解液与蛋白酶在一定温度下进行组织裂解与解交联。
由于FFPE样品包含的DNA分子会彼此交联，并与RNA和蛋白质分子交联，故这些交联必须断裂，才能释放出DNA用于后续纯化。建议在80℃的环境下，孵育样品一个小时，以达到逆转交联的目的。
图源：迪赢生物
福尔马林固定导致核酸之间、蛋白之间以及核酸和蛋白之间的交联。固定时间越长，交联程度越大，纯化难度越大。
利用洗脱液回收核酸。下面以捷倍斯生物的石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(D1705)为例介绍FFPE样本DNA提取纯化步骤。
| 货号 | 产品名称 |
|---|---|
| D1705 | 石蜡包埋组织DNA提取试剂盒 FFPE DNA Kit |
| R7105 | 石蜡包埋组织RNA提取试剂盒 FFPE RNA Kit |
产品介绍:
http://www.gbcbio.cn/Product/D1705.html
产品组分信息：
自备材料
无水乙醇 1.5ml离心管 水浴 离心机、水浴锅、离心机、涡旋仪
实验步骤
1.样本处理
A. 石蜡切片：取石蜡切片（5-10μm厚，1×1cm2大小）5-8张。
B. 石蜡块：手术刀刮取约30mg的组织样本（尽量去除多余的石蜡）。
注意：如果样品表面暴露于空气中，最初刮取的2-3片弃掉不用。
C. 福尔马林等固定液中的样本：取30mg样本，用手术刀切为数块,置于1.5ml离心管中,加入
500μl PBS涡旋振荡混匀12000rpm室温离心1min,重复3次。跳过第二、三步，从第四步起继续操作。
2.将样品置于1.5 ml离心管中，加入500μl Buffer FL1，剧烈涡旋10 sec。
3.90ºC水浴5分钟。
4.加入 200µl Buffer FL2 至样品中，避免剧烈震荡以免蜡体乳化影响后续操作。
5.11,000×g 离心30秒。此时分成两层：上层含蜡层，下层蓝色水相层。（福尔马林等固定样品，无需进行此步操作。）
6.加入 20µl Proteinase K 至下层的溶液中。用移液枪轻轻吸打几次混匀。
7.56℃水浴直至样本完全裂解。 也可以56℃水浴过夜，过夜消化对提取结果无影响。
注意：一般样品，消化1小时即可。
8.置于90℃水浴孵育1h，转移下层水相至新的离心管中。
9.（可选步骤）如果需要得到无RNA的基因组DNA，每个样品加入5μl RNA酶（10mg/ml，需另购买，GBCBIO货号P3414）混匀，室温放置5min。
10.加入220µl Buffer BL与加入220μl 的无水乙醇，涡旋混匀(可能会出现沉淀) 。
11.转移溶液和沉淀入吸附柱中（吸附柱放在收集管中），12,000 rpm(~13,400×g)离心1 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
12.加入500μl Buffer WB至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；
13.加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；
注意：DNA Wash Buffer使用前须按要求用无水乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室温。
14.再加入600μlDNA Wash Buffer至柱子中，10,000×g离心1min,弃去流出液；
15.将GBC吸附柱重新套回2ml收集管中，最大转速（>13.000×g）离心空结合柱1min。
16.将GBC吸附柱转入一个新的离心管中，加 15-30μl TE或者灭菌去离子水，室温放置1分钟，12,000 rpm (~13,400×g)离心30秒。且DNA 应保存在-70℃，以防降解。
5.核酸的质控
对提取出来的核酸进行质控十分重要，对于FFPE样本中提取的核酸，通过吸光度检测样品纯度（Nanodrop），荧光定量（Qubit）及毛细管电泳仪进行测定核酸浓度、OD值（纯度）及片段大小（DIN），除此之外还可参考Alu247/Alu115和Q Score。
参考文献：
Klopfleisch R, Weiss AT, Gruber AD. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol Histopathol. 2011 Jun;26(6):797-810. doi: 10.14670/HH-26.797. PMID: 21472693.
品牌优势
捷倍斯生物可以提供专业和完善的核酸分离纯化解决方案，有硅胶柱法、磁珠法与溶液直接法的核酸纯化产品，在二代测序的样品前处理方面有着专业的技术与积累，有完善的针对唾液、血液与血浆等样品的保存、运输与高通量核酸纯化等整套的解决方案。 在诊断试剂原料方面，捷倍斯生物可以提供生物染色剂、高端的表面活性剂、显色底物、生物缓冲剂以及酶制剂与其稳定剂等系列产品。
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