近年来,随着人类基因组序列测定计划的完成标志着人类已步入后基因组时代!重点为对基因组中个体遗传差异的研究。采用分子标志物从机制上对疾病的病因及遗传易感性进行研究已成为研究的一个热点吗。这种研究需要从大量的人体组织和血液等生物标本中提取 DNA 后进行分析DNA提取的质量好坏是影响后续实验的重要因素。
一 什么是凝血块？
生理性凝血：当血管受损时，血小板会迅速聚集形成“血小板栓”，同时激活凝血因子，形成纤维蛋白网，捕获红细胞，最终形成稳固的凝血块以止血。
病理性凝血：在某些情况下，如高血压、高血脂、血流缓慢或遗传性凝血异常，可能导致血栓形成，阻塞血管，进而引发心梗、脑梗等严重疾病。
三 为什么要提取凝血块DNA?
血样中 DNA的提取在基因工程和分子生物学的研究中占有主要地位。通常，用于PCR反应和其他分子测试的DNA 主要是从抗凝血中提取，但保存的时间长，即使加了枸橼酸钠或EDTA 抗凝剂:也会形成血块，给提取带来不便。而且，对于许多珍贵的、很难收集到的临床血液标本的基因组DNA的提取带来困难。因此是否能有效地从血凝块中提取基因组 DNA并且成功地用于后续实验中就变得十分重要。
纱布条上的凝血块
图源：微博蓝莓医生
四 凝血块DNA提取的难点在哪里？
从凝血块中提取DNA，相比从新鲜的抗凝血中提取，确实面临更多挑战。其难点主要贯穿于从样本本身到提取过程的各个环节。
样本质量与DNA完整性
提取过程的技术障碍
细胞难以充分裂解：凝块中的细胞堆积紧密，并被纤维蛋白网络牢牢固定，这使得裂解液难以有效渗透，导致细胞（尤其是白细胞）无法被完全裂解，DNA释放不充分，最终影响提取效率。
干扰物质(主要包括)
血红蛋白：这是最主要的PCR抑制物之一。如果去除不彻底，微量的血红蛋白残留就足以严重抑制后续的PCR扩增反应。
产品介绍链接：https://www.gbcbio.cn/Product/D1115.html
五 血凝块DNA提取步骤
操作步骤（以GBCBIO--D1115为例）
注意：以下方案适用200mg血凝块的操作方案，更大体系按比例增加相关溶液的用量。DNA Wash Buffer提供的浓缩液，需按前面的说明进行稀释。
1. 取200mg的血凝块于2ml的离心管中。
2. 加入20μl Protease K(20mg/ml)和400μl Buffer BL，最高速度涡旋15秒充分混匀。如果需要得到无RNA的基因组DNA，每个样品加入5μl RNA酶（10mg/ml，需另购买，GBCBIO货号P3414）。
3. 70℃水浴直至血凝块完全消化（一般情况下，10-20min即可）。孵育过程中颠倒混匀几次。
4. 加入250ul无水乙醇（96-100%，室温）至裂解液中，最高速度涡旋20秒混匀，稍微离心以收集盖子上的液滴（可不离心）。
5. 把GBC吸附柱装在在2ml收集管中（已提供），将第4步得到的溶液全部转入柱中，10,000×g离心1min，倒弃流出液重新套上收集管。
6. 加入500μl Buffer WB至柱子中，10,000×g离心1min，弃去流出液。
注意：Buffer WB使用前须按要求用无水乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室温。
7. 将GBC吸附柱重新套回2ml收集管中，加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；
注意：DNA Wash Buffer使用前须要用无水乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室温。
8. 再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g离心1min,弃去流出液；
9. 将GBC吸附柱重新套回2ml收集管中，最大转速（>13.000×g）离心空结合柱1min以干燥柱子的基质；这一步对下面的洗脱步骤至关重要。
10. 将柱子置于1.5ml灭菌离心管，加入30-80μl 65℃预热的TE或灭菌去离子水至柱子的膜中央。 室温静置于5min；
11. 室温下，离心(>13.000)1min，以洗脱DNA。保留含DNA的流出液。将DNA储于-20℃。注意：为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2分钟，1,2000rpm离心2分钟。洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。
六 凝血块DNA提取的难点总结
样本预处理：打破物理屏障--凝血块最棘手的问题是其致密的纤维蛋白网状结构，这会阻碍裂解液的渗透
避免反复冻融：如果样本是冻存的，应尽量避免反复冻融。反复冻融会加剧DNA的断裂，导致提取出的DNA片段变小，影响后续实验（如长片段PCR或文库构建）。
裂解与消化：确保DNA充分释放--是决定得率高低的核心步骤，必须确保细胞核被彻底打开
现配现用：蛋白酶K溶液在室温下不稳定，应避免长时间放置或反复冻融，以免活性降低
延长消化时间：相比新鲜血液，凝血块的消化时间通常需要延长。一般建议在55℃-65℃下孵育，时间可从1小时延长至过夜，直到溶液变得清亮或仅有少量沉淀
温度控制：裂解过程通常在56℃或65℃进行。如果使用的是某些特定缓冲液（如Buffer GC），在70℃孵育有助于去除杂质，但需严格按照说明书操作；
防止沉淀干扰：在裂解过程中可能会出现白色絮状沉淀（通常是蛋白质），这属于正常现象。只要充分震荡混匀，通常不会影响后续结合。
除杂质与抑制物：保证DNA纯度--凝血块中含有大量的血红蛋白，这是PCR反应的强抑制剂，必须彻底去除
乙醇添加：务必在使用前向洗涤液（Wash Buffer）中加入指定量的无水乙醇，否则无法有效去除盐分和杂质；
增加洗涤次数：如果样本量较大或颜色较深，可以适当增加洗涤步骤的次数，确保血红蛋白等杂质被洗净；
空离干燥：彻底去除残留乙醇这是最容易被忽视但影响最大的一步在最后一次洗涤后，必须将吸附柱放回收集管，进行高速离心（如12,000 rpm，2分钟），以甩干残留的乙醇；
晾干：离心后，建议将吸附柱在室温下开盖放置几分钟，让乙醇挥发殆尽。乙醇残留会严重抑制后续的酶切和PCR反应。
品牌优势
捷倍斯生物可以提供专业和完善的核酸分离纯化解决方案，有硅胶柱法、磁珠法与溶液直接法的核酸纯化产品，在二代测序的样品前处理方面有着专业的技术与积累，有完善的针对唾液、血液与血浆等样品的保存、运输与高通量核酸纯化等整套的解决方案。 在诊断试剂原料方面，捷倍斯生物可以提供生物染色剂、高端的表面活性剂、显色底物、生物缓冲剂以及酶制剂与其稳定剂等系列产品。
做值交往的人｜做值得信赖的产品
