一 什么是WB实验?
蛋白印迹也称作免疫印迹（Western Blot简称WB），是一种被广泛应用并得到公认的技术，用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。这一技术利用抗体与特定待检测蛋白的结合，测定生物样本中的蛋白水平。抗体与其靶点蛋白表位的精确结合可用于检测蛋白质中具有高度特异性的氨基酸序列。简而言之：就是抗原抗体反应！
二 WB实验的作用是什么?
从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；
定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；
用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析；
三 WB实验有哪些步骤?
WB实验流程图
3.1 样品裂解制备
组织样本裂解
常见破碎组织的方法： 机械法、匀浆法、超声波破碎解、研磨法，反复冻融法等；
实验室常用的破碎方法：超声波；电动研磨；磁珠破碎法(磁珠高速旋转产生大量热量，需提前预冷机器) 注意发热引起的蛋白变性和聚集，操作过程中尽量减少细节上的差异，才能保证实验结果一致性。
细胞样本裂解
一般裂解液包含以下几个组分: 缓冲系统； 盐离子；离液剂； 蛋白酶抑制剂； 还原剂
根据目的蛋白选择合适的裂解液
常见蛋白酶磷酸酶抑制剂
3.2 凝胶电泳
加入足量的样品和分子量大小标记物
SDS-PAGE 根据蛋白电泳迁移率将其分离，迁移率是蛋白大小和电荷的函数。建议在预制 Tris-Glycine 小孔胶上样20-40μg 全细胞裂解液或100ng纯化蛋白，根据目标蛋白的表达量优化上样量。
对于大分子量靶标，建议采用 Tris-Acetate 凝胶和相关缓冲液；
在待测样本附近的泳道始终加入分子量标记物，作为参考点；
分子量标记物（或梯状条带）是已知分子量的纯化蛋白的混合物；
用预染色标记可以看见电泳过程中蛋白迁移的距离，随后确认经电转移至膜；
采用生物素标记物可以看见膜上的梯状条带和抗体靶标；
捷倍斯生物(GBCBIO)生产的PAGE凝胶快速配制试剂盒(PAGE Gel Quick Preparation Kit-G3402N) 配套改良型促凝剂 ，其具有更好的稳定性和催化效能，配胶过程中无需额外添加恶臭的TEMED，SDS,丙烯酰胺等剧毒试剂,采用上层胶和下层胶的预混配方，只需加入配套促凝剂即可，简便快捷，而且有多种浓度比例可选择。99%的人都不知道的WB制胶技巧及常见问题（附解决方法）
产品介绍：http://www.gbcbio.cn/Product/G3402M.html
预染蛋白Marker作用：
实时监控SDA-PAGE中的蛋白迁移；
检验western转膜效率；
对蛋白大小进行初略鉴定；
呈彩色且转膜效果好。
电泳凝胶制备参考浓度
3.3 转膜
湿转法膜
把蛋白从凝胶转移至膜上的湿转移是指把滤纸-凝胶-膜-滤纸“三明治”完全浸入缓冲液中。使用此方法时，在浸没的情况下通过电泳转移至 0.2 μm 孔径硝酸纤维素膜，在冷却的含 20% 甲醇的转移缓冲液中转膜，70V，1.5小时。
半干法转膜
把蛋白从凝胶转移至膜上的半干转移是指将浸满缓冲液的滤纸-凝胶-膜-滤纸“三明治”系统，置于本应干燥的阳极和阴极板上。
在这一系统中，转移在桌面上进行，在室温条件下约15-60分钟。转移低分子量和高分子量蛋白时这一系统均运转良好，相较于湿转移所需缓冲液更少，但是在某些情况下会产生更高的背景染色。（转膜时不离人，监测电流电压）
干法转膜法
把蛋白从凝胶转移至膜的干转移是指不额外加入缓冲液的系统，因为阳极和阴极板系统中含有缓冲液基质。对于较大分子量蛋白，观察到信号差异最大，表明转移效率低。
（注意：在样本量有限或待检测蛋白低内源水平的情况下，干转移方法会限制您分析的灵敏度。）看了这篇才知道 原来WB转膜竟然有这么知识点和技巧！
Trans Blot
3.4 封闭
建议转移之后迅速在 Tris-Buffered Saline (TBS) 中洗涤膜，以便移除残留的转移缓冲液，随后在室温条件下含5% 脱脂牛奶的 Tris Buffered Saline 和 Tween® 20 去污剂 (TBST)中封闭1小时。这一封闭步骤有助于降低非特异性一抗结合并降低背景。应避免膜封闭时间过长，因为这会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。封闭后在TBST 中洗涤5分钟。封闭只用奶粉和BSA？这6种WB封闭液你学会用了么？
3.5 一二抗孵育
一抗与抗原结合
一抗应在含5% BSA 或5% 脱脂牛奶的 TBST 缓冲液中稀释。
一抗孵育时间会有很大的差别，具体取决于研究人员采用的操作流程。建议在4℃ 过夜孵育一抗。（过夜孵育提高抗体结合）
免疫印迹操作流程的另一个存在差异的方面是洗涤和稀释缓冲液。推荐抗体稀释缓冲液和洗涤步骤使用TBST。(TBST 缓冲液产生更强的信号)
二抗与一抗的结合
建议在含 5% 脱脂牛奶的 TBST 中稀释二抗。
因为脱脂牛奶的封闭要更强，所以基于 BSA 的稀释比基于牛奶的稀释产生的背景明显更强。
如果对免疫沉淀细胞裂解物进行免疫印迹实验，考虑采用构象或链特异性二抗，以避免 IgG 重链或轻链的信号。
3.6 检测
条带的好坏决定实验室的成败，试剂质量 抗体特异性不好整个实验都白费，一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。
HRP-ECL发光法：
将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
捷倍斯生物(GBCBIO)生产的超敏ECL化学发光液（SuperEnhanced ECL-G3308），与进口同类产品的灵敏度相当，背景小，可与二抗上耦连的辣根过氧化物酶发生化学反应，发出荧光，从而可以通过用X光片压片或其它适当荧光成像设备检测样品。
推荐使用的产品
| 货号 | 产品名称 |
|---|---|
| D3433 | DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit |
| G3308 | 超敏ECL化学发光液 SuperEnhanced ECL |
| E1161 | BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒 BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit |
产品介绍:
https://www.gbcbio.cn/Product/G3308.html
AP-NBT/BICP显色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TBST洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果曝光时间长达半小时，出现背景是正常的。
捷倍斯生物(GBCBIO)生产的 BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit-E1161）可以用于细胞或组织的碱性磷酸酯酶显色，也可以用于Western等结合有碱性磷酸酯酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的碱性磷酸酯酶显色。
显色方法选择
四 注意常见问题以及分析
无信号
背景偏高
体而易产生 高背景。
多带现象
背景有不均匀的白色斑点
转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均
背景有黑色斑点
深背景出现白色条带（非预期背景）
分子量蛋白标准条带呈黑色
目的条带染色过低/过高
“微笑”条带
相同的蛋白杂交出现大小不均匀条带
凝胶染色不均匀
| 货号 | 试剂名称-(GBCBIO) |
| G3424 | 高效RIPA组织/细胞裂解液（强） |
| S213 | 蛋白酶抑制剂(动物）|Protease Inhibitor Cocktail |
| S216 | 磷酸酶抑制剂|Phosphatase Inhibitor Cocktail（100X） |
| G3522 | BCA蛋白浓度测定试剂盒|BCA Protein Assay Kit |
|
|
PAGE凝胶快速配制试剂盒 |PAGE Gel Quick Preparation Kit |
| G5550 | 30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29:1)|30%Acrylamide |
| G3407 | 1M Tris-HCl,pH6.8 |
| G3419 | 1.5M Tris-HCl,pH8.8 |
| 04861 | 过硫酸铵APS|Ammonium persulfate |
| 07611 | 四甲基乙二胺|TEMED |
| G3422 | SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)|SDS-PAGE Loading Buffer |
| G4037 | Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液 PH 8.3|Tris-Glycine SDS |
| G4038 | Tris-Glycine Buffer电转缓冲液|Transfer Buffer |
| PPL4 | Prestained protein ladder (10-180 KD) 彩虹预染蛋白Marker |
| G0993 | 10X Western转膜液|Transfer Buffer |
| G7205 | Western 10分钟快速封闭液 FastBlockTM Blocking Buffer |
| G7255 | 通用抗体稀释液(无蛋白) Antibody Dilution Buffer(Protein-free) |
| 0332 | 牛血清白蛋白BSA|Albumin, Bovine, Fraction V |
| G3308 |
超敏ECL发光液|SuperEnhanced ECL |
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品牌优势
捷倍斯生物可以提供专业和完善的核酸分离纯化解决方案，有硅胶柱法、磁珠法与溶液直接法的核酸纯化产品，在二代测序的样品前处理方面有着专业的技术与积累，有完善的针对唾液、血液与血浆等样品的保存、运输与高通量核酸纯化等整套的解决方案。 在诊断试剂原料方面，捷倍斯生物可以提供生物染色剂、高端的表面活性剂、显色底物、生物缓冲剂以及酶制剂与其稳定剂等系列产品。
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