二、真菌DNA提取的难点
细胞壁结构复杂在营养生长阶段，绝大多数真菌会长出可分枝的丝状体，即菌丝。与动物细胞不同，真菌菌丝具有细胞壁结构，且相较于植物细胞壁，真菌细胞壁更厚，结构更为复杂。其主要成分包含纤维素、几丁质等多种复杂化合物，这种复杂的组成结构显著增加了 DNA 提取的难度。为实现细胞壁的充分溶解以释放 DNA，可采用液氮研磨的方法对真菌样本进行预处理；或者选用含有高效裂解酶的试剂盒，如捷倍斯生物(GBCBIO®-D7105）品牌的 Hpure Fungal DNA Kit 真菌 DNA 提取试剂盒，其中的裂解酶能够有效促进真菌细胞壁的溶解，最大程度地释放 DNA,能够从多种真菌的不同样品中提取DNA，特别适合于富含多糖多酚的真菌与真菌的样品。
核酸降解酶的影响：真菌细胞内存在多种核酸降解酶，当细胞破裂时，这些酶会迅速作用于 DNA，导致 DNA 降解，进而影响 DNA 的提取得率。因此，在提取过程中，除了使用无菌无酶的实验仪器外，还需优化实验流程，尽可能使各实验步骤紧密衔接，以最大程度地减少核酸降解。
样本杂质干扰：在真菌样本采集过程中，常混入其他微生物、植物残渣等杂质。这些杂质会干扰 DNA 提取的纯化过程，降低 DNA 提取质量。此外，真菌细胞富含多糖和色素等物质，这些成分容易与 DNA 结合形成复合物，致使提取的 DNA 纯度和得率不理想。
三、 真菌DNA的提取方法
物理破壁辅助法
加热裂解法：向上述备用菌中加100 μL DNA专用提取液，振荡混匀，100℃金属浴10 min，4℃ 12 000×g离心5 min，取全部上清液于–20℃保存备用。
微波法：向上述备用菌中加入200 μL DNA专用提取液，振荡混匀，微波高火30 s，连续4次，4℃ 12 000×g离心5 min，取上清液于–20℃保存备用。
反复冻融法：向上述备用菌中加入1 mL的无菌等渗氯化钠溶液，置–70℃冰箱中10 min，室温融化，重复冻融3次。4℃ 12 000×g离心10 min后去上清液，加入100 μL DNA专用提取液振荡混匀，金属浴加热5 min，4℃ 12 000×g离心5 min，取上清液于–20℃保存备用。
经典化学提取法
溶壁酶法：上述备用菌中加500 μL普通DNA裂解液(10 mmol/L Tris–HCl pH 8.0，10 mmol/L NaCl，pH 8.0的50 mmol/L EDTA)，加溶壁酶(50 mg/mL)10 μL，水浴2 h后。加入等体积苯酚–氯仿–异丙醇(25∶24∶1)，轻轻颠倒混淆1 min，4℃ 12 000×g离心5 min。吸取上清液，用等体积氯仿–异丙醇(24∶1)再抽提1次，4℃ 12 000×g离心5 min；取上清液加入2倍体积无水乙醇，–20℃冰箱静置30 min，4℃ 12 000×g离心5 min，弃上清液，加入200 μL 70%乙醇洗涤，4℃ 12 000×g离心5 min，弃上清液，扣干，加入50 μL Tris–EDTA缓冲液中充分溶解，所提DNA溶液于–20℃保存备用。
蜗牛酶法：蜗牛酶过夜处理法，上述备用菌中加500 μL普通DNA裂解液，蜗牛酶(10 mg/mL)100 μL和100 μL 1% SDS，37℃消化14 h，按上述酚氯仿法抽提纯化。
试剂盒抽提法
硅胶膜吸附法试剂盒：捷倍斯生物(GBCBIO®-D2605）Fungal DNA Kit 真菌DNA提取试剂盒，采用简便的硅胶柱结合纯化方式和独特的溶液处理系统，可处理多个100mg新鲜或30mg干燥真菌组织样品。独特的缓冲液与硅胶柱有效的去除组织裂解物种的多糖，酚类，以及酶抑制物，提取产物DNA可以用于 PCR，Southern杂交，酶切消化等实验。无需使用酚氯仿等有机，可以同时进行多个样品的处理。
磁珠法试剂盒：捷倍斯生物(GBCBIO®-M2605）MagIso Fungal DNA Isolation Kit 是专门为华大制造、KingFisher, 达安、天隆等核酸提取仪设计的产品，适合于从真菌样品中提取核酸。试剂盒基于超顺磁性的磁性粒子纯化技术，可最大程度减少交叉污染的风险，提高检测的灵敏度和准确度。仪器运行时间只需50分钟。得到的DNA可直接用于定量PCR和二代测序等实验。
原理：磁珠特异性吸附DNA，磁场分离。
适用：临床样本（如痰液中的念珠菌）、环境真菌群落。
四、真菌DNA提取试剂盒怎么选？
真菌DNA提取浓度
真菌 DNA 提取浓度是衡量提取试剂盒质量的重要指标之一，也是研究者重点关注的实验结果。
真菌DNA提取纯度
除提取浓度外，真菌 DNA 提取纯度也是评估提取试剂质量的关键指标。通常采用 OD260/OD280 的比值来衡量 DNA 纯度，理想情况下，该比值应介于 1.7 - 1.9 之间。
五、真菌DNA提取特殊样本优化方案
| 样本类型 | 挑战 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 担子菌（蘑菇） |
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| 病原真菌（如白念珠菌） |
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| 环境样本（土壤真菌） |
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六、真菌DNA提取注意事项
破壁优先级：
酵母：酶解（蜗牛酶/Zymolyase）> 机械破壁。
丝状真菌：液氮研磨 > 酶解。
抑制物去除：
多糖：CTAB结合高盐（1.4 M NaCl）或试剂盒去多糖模块。
黑色素：添加1%活性炭吸附（适用于暗色孢科真菌）。
DNA保存：
长期保存用TE缓冲液（pH 8.0），-80℃避光存放。
七、真菌DNA提取方法选择指南
| 场景 | 推荐方法 | 预期得率 |
|---|---|---|
| 基础研究（少量样本） |
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| 临床诊断/高通量 |
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| 宏基因组研究 |
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| 顽固样本（如灵芝） |
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八、真菌DNA提取常用酶解试剂
溶壁酶（Lywallzyme）：广谱裂解真菌细胞壁（终浓度10 mg/mL）。
裂解酶（Lyticase）：针对酵母β-葡聚糖（终浓度1 U/μL）。
几丁质酶：特异性降解几丁质（适用于毛霉等）。
品牌优势
捷倍斯生物可以提供专业和完善的核酸分离纯化解决方案，有硅胶柱法、磁珠法与溶液直接法的核酸纯化产品，在二代测序的样品前处理方面有着专业的技术与积累，有完善的针对唾液、血液与血浆等样品的保存、运输与高通量核酸纯化等整套的解决方案。 在诊断试剂原料方面，捷倍斯生物可以提供生物染色剂、高端的表面活性剂、显色底物、生物缓冲剂以及酶制剂与其稳定剂等系列产品。
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