在原核蛋白表达体系中，如E.coli（大肠杆菌表达系统），外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达，原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列，且密集于染色体上，共同形成一个转录单位——操纵子，也称基因表达的协同单位。E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙酰基转移酶（transacetylase)；此外还有调控基因：操纵序列O（operator）、启动序列P（promoter）；而I(编码Lac阻遏物，Lac repressor)不属于乳糖操纵子。
Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白，每个结构都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物（即下图中的阻遏蛋白）能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，阻止了转录的路径，从而抑制转录启动。而当有诱导剂（这里指IPTG）存在时，诱导剂可与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，启动子P开始发生转录，启动反应开始发生转录。
在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖——即生理上的诱导剂。
IPTG诱导表达原理图
1 β-半乳糖苷酶(β-gal，beta-gal)活性检测
B-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)由大肠杆菌lacZ基因编码，是最常用的一种报告酶，用来研究哺乳动物细胞的基因表达，蛋白-蛋白相互作用，以及标准化转染效率，
检测原理:IPTG诱导lacZ基因表达B-半乳糖苷酶(β-gal)，细胞裂解后，体系中加入无色的ONPG(邻硝基苯-B-D-吡喹半乳糖苷)，被β-gal水解为邻硝基苯酚(o-nitrophenol)，生成黄色(420nm)。颜色反应的强度与β-gal活性成正比。
2 蓝白斑筛选(Blue-white screening)
IPTG普遍用在需要诱导β-gal|活性的克隆步骡中，最为常见的就是和X-gal联合使用进行蓝白斑克隆筛选，或与Magenta-gal联合使用进行红/白斑克隆筛选:
作用机理:当目的基因插入载体lacZ基因，破坏β-gal表达并阻止其表达。细菌在含X-gal的培养基上生长，β-gal水解此底物生成一不可溶蓝色产物，莹落呈蓝色。若-ga!不能表达，细莹壳隆则无法催化X-gal底物，菌落呈白色，以此区分转化重组载体或非重组载体的克隆子。
3 重组蛋白的诱导表达
IPTG也可用于重组蛋白的诱导表达。在这些体系中，待研究蛋白在IPTG诱导型启动子下游编码。IPTG诱导待研究蛋白表达，对细胞裂解后，使用一系列合适方法来纯化蛋白，如His-taq或GST-taq纯化系统(融合相应标签的重组蛋白)。
| 中文名: |
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| 英文名: |
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| 别名: |
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| CAS No.: |
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级别: |
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| 分子式: |
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分子量: |
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Dioxane.............................................................Pass 1H-NM.......................Conforming to the structure Optical Rotation(C=1,DMF:H2O:1)............ -61.6° |
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| 货号 | 产品名称 |
|---|---|
| 1758-1700 | IPTG, Dioxane Free 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 |
| 0789 | ONPG 邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷 |
| 1758-9030 | DL-DTT 1,4-Dithiothreitol 二硫苏糖醇 |
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D-(-)-Arabinose D-阿拉伯糖 |
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X-gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 |
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https://www.gbcbio.cn/Product/1758-1700.html
1.IPTG储存液配制
2.蓝白斑筛选方法
方法1:X-Gal、IPTG加入固体培养基(推荐)
1)高压灭菌已加琼脂的培养基，并冷却到50℃℃左右;
2)每ml培养基内加入10μl 20mg/m|X-gal溶液、10μ 100mM IPTG(使其终浓度达到1mM);
3)加入适量筛选抗生素如氨苄青霉素，卡那霉素，羧苄青霉素等;
4)混匀后倒板，置于无菌超净台内使培养基凝固(通常需要30min)
5)将转化的感受态细胞涂布到上述平台，于37℃倒置培养过夜，观察蓝白斑情况。
方法2:X-Gal、IPTG直接涂布平板表面
1)于无菌超净台内干燥倒好的平板;
2)加120y 20mg/mlX-gal溶液、40μ 100mM IPTG到平板表面，并涂布均匀夏盖整个平板;
3)于无菌超净台内干燥上述平板，至少需要30min;
4)将转化的感受态细胞涂布到上述平台，于37℃倒置培养过夜，观察蓝白斑情况。
方法3:X-Gal、IPTG加入上层培养基(噬菌体)
1)高压灭菌已加琼脂(0.7%)的培养基，并冷却到50℃℃左右;
2)每3ml培养基内加入40ul20mg/mlX-gal溶液、25μl 100mM IPTG;
3)加入细菌和噬菌体混合物，翻转离心管使快速混匀，然后倒入上层平板铺平
4)于30℃℃培养过夜，观察蓝自噬莹斑情况。
3.IPTG诱导重组蛋白的表达
细菌重组蛋白用IPTG诱导表达，有两种基本方法，一种是快速诱导法，并非适合所有蛋白，且产量并非最理想。另一种是慢诱导法，能增强一些蛋白的可溶性。根据具体要求来选择合适方法。
方法1:快速诱导法
1)从一个相对新鲜平板上挑取一个壳隆，接种到含Amp的1-2ml LB培养液，装入15ml离心管，30°C(or 37°C)于摇床培养过值
2)按照1:50(37°C培养1:100)的比例稀释到2ml含Amp的LB培养液，装入15ml离心管，37°C于摇床培养3-4h;3)提前准备1ml LB+Amp+1mM IPTG，装入15ml离心管内，并在使用前15min于37°C预热;
4)从步骡2中培养3-4h的培养液中吸取1ml，装入1.5m|离心管。室温超速离心30s，去除上清液。将菌体沉淀物置于-20°C待
用。【此为未诱导对照】
5)将预热的1ml LB+Amp+1mM IPTG加到上述培养物中，重新置于37°C培养3-4h;此时培养总体积2m，IPTG终浓度未0.5mM.
6)从步骡5中培养3-4h的培养液中吸取1ml，装入1.5m|离心管。室温超速离心30s，去除上清液。将菌体沉淀物置于-20°C冻存。【此为诱导样本】
7)SDS-PAGE检测样本:加入100ul 1Xloading bufer(含1% BME)到未诱导和诱导样本中。漩涡混我10s-1min，或直至看不到细菌团，煮沸3-5min，超速离心30s。
方法2:慢速诱导法
1)-4)步骤同上;
5)将20°C的1mlLB+Amp+1mM IPTG加到上述培养物中，重新置于20°C培养12-16h;此时培养总体积2ml，IPTG终浓度未0.5mM.
6)从步骡5中培养12-16h的培养液中吸取1m|，装入1.5ml离心管。室温超速离心30s，去除上清液。将菌体沉淀物置于-20°C冻存。【此为诱导样本】
步骤3:可溶性蛋白的提取
1)用2ml冰STE(10mM Tris，pH 8.0;150mM NaCl;1mM EDTA;)洗涤细菌沉淀物一次;
2)重悬细莹沉淀物(10ml诱导培养物)，用800ul含100ug/ml溶莹酶的STE;(溶菌酶必须重县前即刻加入);
3)冰浴15min;
4)加入DTT(GBCBIO 货号:1758-9030)使其终浓度为5mM;
5)加入蛋白酶抑制剂(GBCBIO 货号:S213-1ML)。
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