我们经常说抗体使用之前，一定要滴定，得到一个最佳用量，这样标记出的结果漂亮又节省抗体。但实际上，很多FLOWER可能会觉得滴定要做这么多梯度，太浪费抗体，于是作罢。滴定非常重要的。因为抗体太多或太少，都将导致非特异性染色增加、信噪比降低、灵敏度降低、表达水平与染色强度之间缺乏线性，并会增加的实验成本。
靶标不同、染色条件（即染色时间和温度）不同、抗体批号不同，为稳妥起见，均需进行滴定。活细胞和固定细胞可能不同，表面标记和胞内、核内标记也会不同，商品化试剂尽管有推荐用量，但由于他们测试的条件不同，因此必要的时候还是最好滴定。
材料
待滴定的荧光标记抗体
目标细胞（如果含红细胞，事先裂解红细胞。有核细胞悬液浓度～2×10E8/ml）
磷酸盐缓冲液（PBS）
1.2ml EP管
2ul、10ul、20ul、100ul、200ul、1000ul枪头
流式管
流式细胞仪
确定抗体最大用量
1、准备6个EP管（编号1～6），每管加入5ul细胞悬液（大约10E6细胞）。
2、第1管加入0.495ml PBS（作为未染色对照），最终体积为500ul。
3、根据抗体浓度确定要加入的抗体量。举个例子：假设抗体浓度是12.5ug/ml（12.5ng/ul），并假设我们设置的抗体浓度梯度是10ng/ml（第2管）、20ng/ml（第3管）、0.1ug/ml（第4管）、0.2ug/ml（第5管）和1ug/ml（第6管），终体积为500ul，那么这6管加入的抗体量依次为：0.4ul（5ng）、0.8ul（10ng）、4ul（50ng）、8ul（100ng）、40ul（500ng）。
4、各管加入PBS，最终体积为500ul。混合后避光孵育15分钟。
5、500×g离心5分钟，去除上清。加入适量PBS重悬。上机检测，阳性细胞群 至少获取500个事件。
6、分析方法如下：
本图阴性和阳性分群清楚的抗原，以分析CD3为例，所以同时圈中淋巴细胞和单核细胞，这样R2就是阴性细胞群，R3就是阳性细胞群，计算信噪比，阴性群无明显升高而信噪比最高的抗体量，就是最佳抗体用量。
如果是分群不清楚的，例如上图染CD38，那么我们根据未染色管设置一条虚线作为阴性群原本的位置，然后查看阴性群荧光基本上在虚线下，而分群延伸程度最长的就是最佳抗体用量。
最省抗体的滴定方式
这种滴定方式是原文中建议在前面这步确定好最佳抗体用量后进行的，但实际上，我们在实际滴定中可以直接采用该种方式，直接确定最佳抗体使用浓度。
1、标记6根EP管，第一管同样为5ul细胞＋495ulPBS，另外五管依次为：
（1）1000ul总体积，含5ul细胞和0.4ul抗体（这个抗体用量是按照前述12.5ng/ul和最佳用量5ng而确定的）。
（2）500ul总体积，含5ul细胞和0.4ul抗体。
（3）100ul总体积，含5ul细胞和0.4ul抗体。
（4）50ul总体积，含5ul细胞和0.4ul抗体。
（5）10ul总体积，含5ul细胞和0.4ul抗体。
2、充分混合后，避光孵育15分钟。
3、500×g离心5分钟，去除上清。加入适量PBS重悬。上机检测，阳性细胞群 至少获取500个事件。
4、分析示例：
仍然以分群不清的连续性表达（CD38）为例，跟前面一样，根据未染色管设置一条虚线作为阴性群原本的位置，然后查看阴性群荧光基本上在虚线下，而分群延伸程度最长的就是最佳抗体用量。但本例中，似乎最佳浓度应该是大于我们本例最大浓度0.5ug/ml。
需要强调的几点
1、使用抗体时，抗体的浓度是最关键的，所以相对来说，细胞数量的弹性大，但体积就不行，一旦你增加了染色体积，你必须得增加相应量的抗体用量，以使得抗体浓度保持稳定。
2、用于滴定抗体的标本中，必须要确保有一类不表达该抗原的细胞，如果没有阴性的细胞，可考虑将阴性细胞掺入。
3、一旦滴定完成，请在文章中提供你滴定出的最佳浓度，而不是稀释比。