《西游记》中唐僧师徒四人，不远万里到西天取经，历尽千难万险，最后胜利取得真经，个中的原因有种种，你体会的最深的是哪个？
师傅的“碎碎念”
“贫僧从东土大唐来，要到西方拜佛求经，路过此地…….”
师傅一直把目标反复灌输给我们，让我们明确目标，努力向前
还有……….
这次听听技术们说做Seahorse实验成功的那些“碎碎念”
1. 实验前一天：开机，开软件，水化板子，贴壁细胞种细胞，这些事情要提前做；
2. 水化探针板时候需要留意的一些问题：水化探针，需要放在普通的37ºC 无CO2恒温箱水化，无需特殊的三气培养箱；水化过夜，至少12小时；
3. 第二天做实验前，探针板加药前一定要手动排下气泡，二步法水化，实验当天更换下预热好的水化液，再放置无CO2恒温箱孵育1小时；24机型探针板一步法水化即可，但是还是建议用之前手动排一下气泡；
4. 细胞的密度需要摸索，在实验上机前，长满底面积80-90%为最佳，设置一个密度梯度，找到最佳的密度；
5. 种细胞时候，枪头抵壁，与水平面呈45°角度加入，加完在超净台静置30分钟以上，不要晃动细胞板，避免细胞分布不均，减少边缘效应；
6. 做OCR（线粒体压力测试）实验时，需要在适合的细胞密度下摸索FCCP的浓度；
7. 要预留空白对照孔，对照孔除了没有细胞，其它所有操作和细胞孔一致；
8. 细胞板、探针板、溶解后的药物都要一次性用完，所有的孔都需要加液体，没有细胞的孔，按照背景孔处理，即加同等体积液体；
9. 背景孔的加药孔也必须添加液体，保证所有的A加药孔体积一致，B、C、D孔同理，否则会造成打药失败；
10. 加药时同样方法，枪头抵着加药孔壁大约与水平面呈45°度角，将液体一次性加入到加药孔中，注意板子始终保持在平面上，加完药的探针板不能晃动，以免加入的液体漏入水化板中。（24的机型，在加药前需要取下粉色的水化辅助板）；
11. 探针板和细胞板放入仪器时，朝向为A1孔朝向机器内部，记得把盖子拿掉；
好了，唠叨完，我们接下来说正事：
安捷伦 Seahorse XF 培养基专用于 XF 分析，推荐研究者使用，以获得最佳试验结果。XF 培养基以标准细胞培养基组分（DMEM 或 PRMI）为基础，在以下方面进行 了改进：
无碳酸氢盐和低缓冲容量：利于细胞外酸化率的检测
无底物添加：适用于用户的各种不同需求
低浓度酚红或无酚红：确保 pH 值测量的准确性
安捷伦 Seahorse 现提供在 37 ºC 下预调节 pH 为 7.4 的缓冲 XF 培养基（部件号 103575-100 和 103576-100）。这些培养基含有少量的 HEPES 缓冲液。如果在此培养基中添加推荐浓度的 XF 补充剂（如 XF 葡萄糖溶液、XF 丙酮酸盐溶液和 XF 谷氨酰胺溶液），就无须再调节 pH 值，从而简化工作流程并缩短试验准备时间。这些 pH 预调培养基具有均衡稳定的缓冲容量，从而使得试验结果更加稳定可信。
用 pH 7.4 的 XF DMEM 或 RPMI 培养基制备安捷伦 Seahorse XF 试验用培养基 的最佳实践方案：
1. 在使用当天将足量 pH 7.4 的 XF DMEM 或 RPMI 培养基转移至一个新的无菌瓶中（记得在安全柜中打开）。注：如果当天试验只需少量培养基，建议不要预热整瓶，且每次使用过后拧紧瓶 盖以保持 pH 值不变
2. 在生物安全柜中加入适量 XF 补充剂/底物 注：必须在推荐的浓度范围内使用 XF 补充剂，以确保分析培养基具有准确的 最终 pH 值。如果使用其他供应商提供的其他品牌的补充剂，则无法保证培养 基具有准确的 pH 值。推荐的补充剂浓度为葡萄糖 0–10 mmol/L、丙酮酸盐 0–1 mmol/L、谷氨酰胺 0–2 mmol/L。特定补充剂浓度取决于不同试验需求。参 见 XF 分析培养基的制备流程和 XF 分析试剂盒用户指南了解详细信息。如果培养 基和所有补充剂的无菌状态未受到破坏，则不需要对最终分析培养基进行过滤除菌
3. 将培养基预热到 37 ºC。分析培养基即可用于分析（无需调节 pH）
用需要调节 pH 的培养基制备安捷伦 Seahorse XF 分析培养基的最佳实践方案：
1. 在使用当天将足量 XF 培养基转移至一个新瓶中（记得在安全柜里打开）
2.在生物安全柜中加入适量补充剂/底物 注：制备用于糖酵解速率测定的分析培养基时，需要在 DMEM 培养基中分别加入 5 mmol/L 或 1 mmol/L 的 HEPES 缓冲液。而对其他 XF 分析的培养基，可以不加 HEPES
3. 将培养基预热到 37 ºC
4. 将 pH调至 7.4 ± 0.1
5. 调节 pH 值后对培养基进行过滤灭菌。分析培养基即可用于分析
安捷伦 Seahorse XF 培养基、缓冲液和补充剂产品
目录号 |
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XF DMEM 培养基，pH 7.4 ,500ml ,无酚红 |
103576-100 |
XF RPMI 培养基，pH 7.4，500ml,无酚红 |
102353-100 |
XF Base Medium,2*1000ml,含酚红 |
103193-100 |
XF Base Medium 培养基 100ml,含酚红 |
103577-100 |
XF 1.0M 葡萄糖,50ml /瓶 |
103578-100 |
XF 100 mM 丙酮酸,50ml /瓶 |
103579-100 |
XF 200 mM 谷氨酰胺,50ml /瓶 |
前面的知识点复习看这里：
• 采用 Seahorse Wave 软件可轻松创建分析实验方案和分析数据
• 采用 Seahorse XF 细胞线粒体压力测试检测线粒体功能
• 采用 Seahorse XF ATP速率测试快速完成功能与能量代谢表型分析
• 采用 Seahorse XF 糖酵解压力测试检测细胞利用糖酵解通路满足能量需求的能力
声明：本技术概述来源于细胞分析团队
阅读须知：仅供个人谨慎参考，详细信息参考原文,欢迎批评指正！
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