Seahorse XF实时ATP速率测定试剂盒

实验背景

     细胞三磷酸腺苷(ATP)的产生速率是一种描述细胞代谢的信息含量很高的测量，因为

ATP是细胞内普遍存在的主要能量货币。细胞的代谢调控使细胞根据ATP需求的变化调整ATP产生的变化来维持总的细胞内的ATP水平。

     安捷伦Seahorse XF实时ATP速率测定被设计用来测量活细胞总的ATP产生速率。更重要的是，这个实验能够区分哺乳动物细胞内两条主要的产生ATP的代谢途径线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解ATP的产生。

Seahorse XF实时ATP速率测定利用代谢的调节剂（寡霉素（Oligomycin），鱼藤酮（Rotenone）及抗霉素A（Antimycin A）的混合物，见图1），当连续加药后，可以计算线粒体和糖酵解的ATP产生速率。配合Seahorse XFe24，XF96或XFe96分析仪，SeahorseXF实时ATP速率测定通过提供细胞ATP产生速率的实时测量和细胞能量平衡的定量表型为细胞生物能量学提供了一个新的动态和定量的视角。

图1. 安捷伦Seahorse XF实时ATP速率测定方案-OCR和ECAR测量的动力学曲线。

  首先测量基础OCR和ECAR。加入寡霉素导致线粒体ATP合成受到抑制从而引起OCR减少，使mitoATP产生速率得以量化。ECAR数据结合检测液的缓冲系数可以计算总的质子流出速率（PER）。用鱼藤酮和抗霉素A完全抑制线粒体呼吸能够计算线粒体相关的酸化，结合PER数据能够计算glycoATP产生速率。

    哺乳动物细胞中，糖酵解和氧化磷酸化（OXOHOS）途径提供大部分的细胞ATP。氧化磷酸化消耗O2，驱动氧气消耗速率（OCR），这两条途径都能导致检测液酸化。葡萄糖通过糖酵解转换成乳酸，每分子乳酸伴随着一个H+流出，而TCA循环使ETC/氧化磷酸化产生CO2，也会导致检测液酸化。这些反应的总和是细胞外酸化（ECAR）变化的主要驱动因素。

    SeahorseXF技术同时测量H⁺产生（ECAR）和O₂消耗（OCR）的流量。通过获得这些基础条件下和连续添加线粒体抑制剂（寡霉素和鱼藤酮/抗霉素A）后的数据，总的细胞ATP产生速率和途径特异性的mitoATP和glycoATP产生速率能够被免标记实时测量。将OCR和ECAR数据转换成ATP产生速率的一系列计算描述如下，在获取数据后使用Seahorse XF实时ATP速率测定报告生成器进行计算。

糖酵解ATP产生速率的计算

     糖酵解途径一分子葡萄糖转换成乳酸的过程中，产生2分子ATP，H+和乳酸（方程式1）：

葡萄糖 +2 ADP+ 2 Pi     2乳酸 + 2 ATP + 2 H2O + 2 H+    （方程式1）

   

     考虑到糖酵解途径的化学计量学（方程式1），糖酵解途径的ATP产生速率（glycoATP产生速率）等于糖酵解质子流出速率（glycoPER，方程式2），并且可以用安捷伦SeahorseXF糖酵解速率测定之前验证过的相同方法来计算（有关详细信息，请参阅White paper:

Improving Quantification of Cellular Glycolytic RateUsing Agilent Seahorse XF

Technology）

glycoATP产生速率（pmol ATP/min）= glycoPER（pmol H+/min）（方程式2）

线粒体ATP产生速率的计算

     在OXOHOS中与ATP产生偶联的氧消耗速率可以通过加入ATP合酶抑制剂寡霉素抑制的OCR来计算（方程式3）：

OCRATP（pmol O2/min）= OCR（pmol O2/min）- OCROligo（pmol O2/min）  （方程式3）

     从OCRATP转换为线粒体ATP产生速率包括：乘以2将O2分子转变成消耗的氧（O）原子，然后乘以P/O值，即一对电子通过电子传递链每还原一个氧原子，磷酸化为ATP的ADP分子数（方程式4）。

      Seahorse XF实时ATP速率测定在这些计算中使用的平均P/O值为2.75，这个值在多种细胞不同底物可用性的条件下都得到验证，能够准确反映实验条件（参阅WhitePaper: Quantifying Cellular ATP Production Rate UsingAgilent Seahorse XFTechnology）。

   基于这些考虑，线粒体ATP产生速率根据方程式4计算：

mitoATP产生速率（pmol ATP/min）=OCRATP（pmol O2/min）* 2（pmol O/pmol O2）* P/O（pmol ATP/pmol O）  （方程式4）

    最后，总的细胞ATP产生速率（方程式5）是糖酵解和线粒体ATP产生速率的和：

ATP产生速率（pmol ATP/min）= glycoATP产生速率（pmol ATP/min）+ mitoATP产生速

率（pmol ATP/min）（方程式5）

词汇表

• glycoATP产生速率(glycoATPProduction Rate)：糖酵解途径中葡萄糖转变成乳酸相关的ATP产生速率(以pmol ATP/min来表示)。

• mitoATP产生速率(mitoATPProduction Rate)：线粒体氧化磷酸化相关的ATP产生速率(以pmol ATP/min来表示)。

• 总的ATP产生速率(Total ATP Production Rate)：活细胞在适当的实验条件下线粒体ATP产生速率和糖酵解ATP产生速率之和。

• P/O值(P/O ratio)：一对电子通过线粒体电子传递链每还原一个氧原子(O)合成的ATP分子数(即磷酸化为ATP的ADP摩尔)。

• XF ATP速率指数(XF ATPRate Index)：在一定时间点，mitoATP产生速率除以glycoATP的比值。这是一个有价值的检测代谢表型变化和/或差异的指标。XF ATP速率指数的增加表示更多的氧化/更少的糖酵解表型，反之亦然。

• 诱导实验(Induced Assay)：XF实时ATP速率测定工作流程包含一次在连续注射寡霉素和鱼藤酮/抗霉素A之前的实验化合物急性注射。此工作流程能够测量ATP产生的原位激活或抑制，以及XF ATP速率指数(mitoATP产生速率/glycoATP产生速率)的实时改变。

• 缓冲系数(Buffer Factor)：测量系统的缓冲能力，包括检测液和XF实验条件(仪器，探针，实验耗材)。

• 糖酵解(Glycolysis)：在Seahorse XF实验中，由葡萄糖转变成乳酸的过程。

• 质子流出速率(Proton Efflux Rate)：随着时间的推移，细胞排出到检测液中的质子数，以pmol/min来表示。

• 糖酵解质子流出速率(Glycolytic Proton Efflux Rate)：来源于糖酵解的质子流出速率(扣除CO₂依赖的酸化的影响)。这个测量指标与细胞外乳酸的产生速率高度相关。

• ATP偶联的呼吸(ATP coupled respiration)：基础呼吸中被用来驱动ATP产生的部分。通过注射ATP合酶抑制剂寡霉素进行定量。

2、试剂盒的信息

    试剂盒内容：

Seahorse XF实时ATP速率测定试剂盒包含6个箔袋，每袋包含的试剂足够用于在一块96或24孔安捷伦Seahorse XF细胞培养微孔板进行一次完整的XF实时ATP速率测定。

    每袋包含一管寡霉素和一管鱼藤酮+抗霉素A的混合物（见表1）。

表1  Seahorse XF实时ATP速率测定试剂盒内容

化合物	靶点	盖子颜色	每管的量
寡霉素	ATP合酶抑制剂（复合物V）	蓝色	63 nmol
鱼藤酮+抗霉素A(Rot/AA)	分别为线粒体ETC复合物I和III	红色	每个27 nmol

试剂盒的运输和储存：

产品在室温运输，可以在室温储存。产品自生产日期开始起18个月内保持稳定（标在盒子上）。

额外需要的安捷伦产品：

    以下安捷伦产品也是进行Seahorse XF实时ATP速率测定所需要的，但试剂盒不提供。有关进行XF试验所需材料的完整清单，请访问网站上运行XF实验的基本步骤

http://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/how-to-run-an-assay

物品	供应商	目录号
XF96, XFe96或 XFe24分析仪 与XF24或XF24-3分析仪不兼容	Agilent
XFe96和XF96分析仪 配套的V3PS细胞培养微孔板； XFe24分析仪 配套的V7PS细胞培养微孔板	Agilent	101085-004 100777-004
Seahorse XF DMEM培养基,pH7.4 Seahorse XF RPMI培养基,pH7.4	Agilent	103575-100 103576-100
使用的分析仪配套的Seahorse XF FluxPak	Agilent	各种
SeahorseXF 1.0M葡萄糖溶液	Agilent	103577-100
SeahorseXF 100 mM丙酮酸钠溶液	Agilent	103578-100
SeahorseXF 200mM L-谷氨酰胺溶液	Agilent	103579-100

3、实验流程

图2.安捷伦Seahorse XF实时ATP速率测定工作流程

实验前一天

1、 打开Seahorse XFe/XF96或XFe24分析仪，使温度稳定。

2、 对于贴壁细胞，用适当的细胞生长培养基将细胞以预先确定的密度接种到Seahorse XF微孔板。请参考运行XF实验的基本步骤，详细信息位于
http://www.agilent.com/en-us/products/cell-analysis-(seahorse)/basicprocedures-to-run-an-xf-assay。

对于悬浮细胞，见以下章节：实验当天/准备Seahorse XF细胞培养微孔板。

3、 在37℃无CO2培养箱中过夜水化探针板（参考基本步骤）。

4、 在Wave里设计实验或使用ATP产生速率实验模板（标准或诱导的实验）。根据特定实验设计，对模板进行必要的分组修改。

实验当天

1、无菌条件下,往100mL Seahorse XF DMEM培养基,pH7.4中添加10mM XF葡萄糖,1mM XF丙酮酸钠,2mM XF谷氨酰胺。这些是推荐的起始条件;然而,所需的检测液组分可根据细胞类型或体外培养条件而改变。

2、温热检测液到37℃。

3、37℃孵育直致准备使用。

注意  如果检测液与此配方有显著不同（即更高浓度的XF葡萄糖，XF丙酮酸钠或XF谷氨酰胺和/或其他培养基添加剂），如有必要，检查检测液的pH值并调至7.4，需按照Buffer Factor Protocol测定缓冲系数值。查阅Seahorse XF Buffer Factor Protocol User Guide。

准备Seahorse XF细胞培养微孔板：

对于贴壁细胞：

1、从37℃ CO2培养箱中取出细胞培养微孔板，在显微镜下检查细胞以确认种板的一致性和正常的细胞形态。

2、弃去细胞培养微孔板中的细胞生长培养基。使用多通道移液器用预热的检测液洗细胞一次，然后置于37℃无CO2培养箱中用检测液孵育45-60分钟。

3、在开始XF实验前，再次弃去检测液并在每孔加入新鲜，预热的检测液（见第15页的表4了解合适的起始体积）。

对于悬浮细胞：

1、从生长培养基中沉淀细胞，并用预热的检测液重悬。

2、计数细胞，以这样一个浓度悬浮细胞，即50 μL（XF96/XFe96）或100 μL（XFe24）细胞包含每孔所需要的细胞数，留4个没有细胞的孔作为背景校正孔。

3、加入所需的细胞/孔，然后温和地离心使细胞贴壁。

4、每孔轻轻加入检测液。总体积应与第15页表4所示相应的细胞孔起始体积一致。

实验前将板子放在37℃无CO2的培养箱中孵育45-60分钟。

准备化合物储液：

   注意  使用当天配制的化合物。不要冻存。丢弃任何剩余的化合物。

1、从试剂盒中取出一个铝箔包，然后打开袋子并取出寡霉素（蓝色盖子）和鱼藤酮/抗霉素A（红色盖子）管。

2、轻弹管子确保在打开管子前粉末在管子底部。

3、按照表2，用适当体积的检测液重悬每种组分。旋涡震荡~1分钟以确保化合物完全重悬。

表2  储液

化合物	检测液体积	储液浓度
寡霉素	420 μL	150 μM
鱼藤酮+抗霉素A	540 μL	50 μM

准备加入探针板加药孔中的化合物

如表3所述，每种化合物各用检测液配制3mL。推荐使用1.5μM的寡霉素和0.5μM的鱼藤酮+抗霉素A（终浓度）。

表3   化合物的配制，用于在XF96，XFe96或XFe24分析仪上进行XF实时ATP速率测定

	储液体积 (μL)	检测液体积 (μL)	10X加药孔 (μM)	细胞孔 (μM)
加药孔A 寡霉素	300	2700	15	1.5
加药孔B Rot/AA	300	2700	5	0.5

将化合物加入探针板加药孔中

• 标准实验-在寡霉素和鱼藤酮/抗霉素A之前没有急性注射。将化合物加入已水化的探针板加药孔中：

  加药孔A：寡霉素

 加药孔B：鱼藤酮/抗霉素A

• 诱导实验-注射一种测试化合物，加入加药孔A中，按如下所示：

  加药孔A：实验化合物（急性注射）或溶剂对照

  加药孔B：寡霉素

  加药孔C：鱼藤酮/抗霉素A

表4 列出了使用两个或多个加药孔时，加药的合适体积和浓度方案。

表4  细胞孔检测液起始体积和化合物加入体积。

	安捷伦 XFe/XF96分析仪		安捷伦 XFe24分析仪
	细胞孔起始体积：180 μL检测液		细胞孔起始体积：500 μL检测液
加药孔	体积	浓度	体积	浓度
A	20 μL	10X	56 μL	10X
B	22 μL	10X	62 μL	10X
C	25 μL	10X	69 μL	10X
D	27 μL	10X	75 μL	10X

在Seahorse XFe分析仪上加载模板

（如果模板已经存在，请跳过这一步。）

个人电脑（需要接入互联网）

1、从安捷伦科技网站下载Seahorse XF实时ATP速率测定报告生成器。XF实时ATP速率测定标准和诱导实验的模板都包含在下载文件夹里。

    注意 当注册下载报告生成器和相应的实验模板时，选择恰当的Seahorse XFe分析仪（SeahorseXFe96或XFe24）。

2、转移到一个USB或驱动器或网络驱动器(如果Seahorse XFe分析仪已联网)。

Seahorse XFe96/XFe24分析仪

1、把USB驱动器插入前置USB接口并等待~10秒钟。

2、点击Import（New Assay视图的底部）。

3、在USB或网络驱动器上定位到实验模板。

4、点击Windows对话框中的Open。

5、如果需要的话，导入下一个模板。

6、导入的实验模板在可用的模板列表中可供选择。拔出USB。

运行XF实时ATP速率测定

1、从可用模板列表中选择Seahorse XF Real-Time ATP Rate Assay或Seahorse XF

Real-Time ATP Rate Assay (Induced Assay)模板，然后点击Open File（或双击模板）。

2、Group Definitions：确认或修改默认的实验组别和条件。

3、Plate Map：确认或修改实验分组。

4、Protocol：确认或修改仪器运行程序。

5、Run Assay：准备好了点击StartRun。

6、当提示出现时，把已加药的探针板和校准板放入Seahorse XFe分析仪，然后点击I'mReady。校准大约需要15-30分钟。

注意  移除探针板盖子并确认正确的板放置方向。

7、完成校准以后，Wave控制器将显示一个加载细胞板的信息。点击Open Tray来弹出校准板并加载细胞板。确保在加载前取下细胞板盖子。

8、点击Load Cell Plate运行实验。

使用安捷伦Seahorse XF实时ATP速率测定报告生成器

安捷伦Seahorse XF实时ATP速率测定报告生成器自动计算XF实时ATP速率测定的参数（mitoATP产生速率，glycoATP产生速率，总的ATP产生速率，XF ATP速率指数，%糖酵解和%氧化磷酸化）。Seahorse XF实时ATP速率测定报告生成器既可以用于标准实验也可用于诱导实验，提供一份方便的单页实验总结。

报告生成器可以从安捷伦网站下载。请访问

https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/xf-real-time-atp-rate-assay-report-generator 来了解更多关于Seahorse XF实时ATP速率测定报告生成器和下载用户指南。

1、实验结束后，打开Wave Desktop或Wave Controller里您的文件。

2、打开Overview选项，查看OCR和PER数据。确认检测液和缓冲系数被分配到了每组，包括背景孔。

3 、点击Export选项并选择Microsoft Excel将完成的运行以.xlsx文件导出。

4、加载XF实时ATP速率测定报告生成器里的数据文件并选择要显示的组。如果实验有多于3次的注射加药，选择是否有一次急性注射，哪次注射对应寡霉素。Rot/AA将被自动分配为在寡霉素之后加入。

5、 点击Update Summary来获得XF实时ATP速率测定报告。

更多详情，请查阅Agilent Seahorse XF Real-Time ATP Rate Assay ReportGenerator User Guide。

   观看一个简短的使用XF ATP速率实验报告生成器逐步进行数据分析的教学视频。

https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/analyze-xf-real-time-atp-rate-assay

4、 常见问题

• 如果检测液中含有不同的氧化底物（不同的P/O值），mitoATP产生速率如何计算？

为了将ATP偶联的呼吸转换为线粒体的ATP产生速率，在电子传递链末端每还原一个氧原子，ADP磷酸化为ATP的化学计量学必须得到确定。不同的底物理论上最大的P/O值不同，并且依赖于化学计量学/底物氧化通路，以及F₁F₀ ATP合酶的效率。在标准的XF实验条件下，细胞被供给底物混合物（主要是葡萄糖，丙酮酸和谷氨酰胺），且通常内源性底物储备（糖原，脂肪酸，其他氨基酸）可用于线粒体氧化。因此，用几种细胞系进行了测试并确认P/O值2.75准确代表了外源性和内外源性氧化底物混合物的平均P/O值。如需更多信息，请参阅白皮书：“Quantifying Cellular ATP Production Rate Using Agilent Seahorse XFTechnology”，位于

https://seahorseinfo.agilent.com/acton/fs/blocks/showLandingPage/a/10967/p/p-0157/t/page/fm/1

• 当进行诱导的XF实时ATP速率测定时，诱导的速率是如何计算和报告的？

在XF实时ATP速率诱导实验中Summary Printout和Measure Sheet中的 Average Assay Parameter Calculations显示的InducedRate(s)是用急性注射和寡霉素注射之间所有测量的平均值计算的。然而，每个时间点的诱导速率可以从Kinetic Rate Data（Measure Sheet）中获得。

• XF实时ATP速率测定中定义的XF ATP速率指数是什么？

XF ATP速率指数是mitoATP产生速率与glycoATP产生速率的比值（即mitoATP rate/glycoATP rate）。这个比值是一个细胞代谢表型的定量指标。代谢指数大于1代表大于50%的细胞ATP来自线粒体的ETC/氧化磷酸化，而指数小于1表示大于50%的总ATP是糖酵解途径产生的。因为代谢指数是比值测量，所以它对于代谢表型的改变或转换是高度敏感的。

• 为什么相同的细胞类型当细胞以不同的密度种板时XF ATP速率不一样？

细胞的代谢表型会被细胞对ATP的需求所影响。一般来说，处于增殖或分化中的细胞比融合（缓慢生长）或末端分化的细胞拥有更高的糖酵解速率。为了比较实验之间的结果，推荐在整个研究过程中保持一致的细胞培养条件和细胞接种密度。

• 为什么必须用Seahorse XF DMEM培养基，pH 7.4或Seahorse XF RPMI培养基，pH 7.4来进行这个实验？

GlycoATP产生速率的计算需要对XF实时ATP速率测定中的糖酵解质子流出速率进行绝对测量。为了正确计算PER，检测液必须要有一个固定的缓冲能力。培养基中低浓度的HEPES 在实验的时间范围内提供了一致的缓冲能力值。虽然添加HEPES缓冲液轻微地减少了ECAR信号，但是它显著提高了ECAR数据的质量和一致性，以及转换为PER的准确性（更多详情，请参阅White paper: Improving Quantification of CellularGlycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology）。此外，使用预调pH到7.4的XF DMEM或XF RPMI培养基节省了实验准备的时间，确保XF实验过程中一致的检测液pH值。

• 我能够使用其他的Seahorse XF检测液来运行XF实时ATP速率测定吗？

   GlycoATP产生速率的准确计算需要使用一种没有酚红和碳酸氢钠且低浓度HEPES缓冲液的检测液。因此，强烈推荐使用安捷伦Seahorse XF DMEM（或RPMI），pH 7.4的培养基。任何偏离推荐的培养基和补充剂（葡萄糖，丙酮酸钠，谷氨酰胺），需要根据经验（使用XF分析仪）确定每个实验的缓冲系数（参阅Seahorse XF Buffer Factor Protocol以进一步了解信息）。任何含有酚红的检测液不能在XF实时ATP速率测定中使用。

• 当运行诱导的XF实时ATP速率测定时，寡霉素注射之后的OCR高于基础OCR，发生了什么？

    在寡霉素注射之前加入的化合物使电子传递与氧化磷酸化解偶联（如FCCP，DNP等等），通常会导致OCR增加。然而，这种呼吸不与ATP的产生偶联，因为没有ATP合酶的参与，线粒体膜电位会减少或消除，所以在这种环境下很少或没有ATP生成。在这些情况下，基础的mitoATP产生速率不能够被准确计算。如果怀疑存在解偶联化合物，那么推荐添加一组对照组，注射检测液+溶剂来计算基础的mitoATP产生速率。

声明：仅供研究使用，不用于诊断性操作。

版权说明：本中文用户手册来源于安捷伦细胞分析团队，仅供参考，如有疑问请联系我们微信号13636671781，获取相关须知。

了解更多信息，请联系Agilent 技术热线：800-820-3278 ， 400-820-3278（手机）