Seahorse XF 糖酵解压力测试试剂盒

全面了解细胞糖酵解功能

 安捷伦Seahorse XF 糖酵解压力测试是测量细胞糖酵解功能的标准方法。直接测量细胞外酸化速率（ECAR)，见图1。Seahorse XF糖酵解压力测试是一种标准和全面的评估糖酵解通量的关键参数的方法：糖酵解，糖酵解能力，糖酵解储备和非糖酵解的酸化。（详情请参考“词汇表”。）

1、实验背景

 糖酵解和氧化磷酸化是细胞内两条主要的能量生产途径。大多数细胞具有在这两条途径之间转换的能力，从而适应环境的改变。细胞中的葡萄糖（Glucose）转变成丙酮酸（称之为糖酵解），随后在细胞质中转变成乳酸，或在线粒体中转变成CO2和水。葡萄糖转变成丙酮酸和后来的乳酸，导致质子的净生产并排到细胞外培养基中（图2）。质子的排出导致细胞周围的培养基酸化。

   XF仪器直接测量酸化速率，以ECAR来表示这一指标。以下是实验流程。

首先，细胞在无葡萄糖和丙酮酸钠的糖酵解压力测试检测液中孵育，并测量ECAR。第一次注射的是饱和浓度的葡萄糖。细胞利用加入的葡萄糖并通过糖酵解通路将其分解成丙酮酸，产生ATP，NADH，水和质子。

    质子排出到周围溶液中引起ECAR快速增加。这种葡萄糖诱导的反应被称为基础条件下的糖酵解速率。第二次注射的是寡霉素（Oligomycin),一种ATP合酶的抑制剂。寡霉素抑制线粒体ATP的产生，将能量产生途径转换到糖酵解，随后ECAR增加显示细胞最大的糖酵解能力。

    最后注射2-脱氧葡萄糖（2-deoxy-glucose，2-DG），一种葡萄糖类似物，通过竞争性结合葡萄糖己糖激酶，糖酵解通路的第一个酶，抑制糖酵解。因此导致的ECAR减少证实实验中产生的ECAR来源于糖酵解。糖酵解能力和糖酵解速率的差值定义为糖酵解储备。葡萄糖注射之前的ECAR，被称为非糖酵解的酸化；是细胞除糖酵解之外的过程引起的。

图1  安捷伦Seahorse XF糖酵解压力测试曲线，展示糖酵解功能的关键参数。依次加入化合物来测量糖酵解，糖酵解能力，并能计算糖酵解储备和非糖酵解酸化。

图2  安捷伦SeahorseXF糖酵解压力测试中糖酵解的调节剂。这张图呈现的是糖酵解及试剂盒中化合物作用位点的简化示意图。葡萄糖给糖酵解提供燃料。寡霉素抑制线粒体的ATP合酶导致对糖酵解的依赖性增加。2-DG是一个葡萄糖的竞争性抑制剂，它的功能是关闭糖酵解。

表1   安捷伦Seahorse XF糖酵解压力测试试剂（按注射的次序）

化合物	靶点	对ECAR的影响
葡萄糖	糖酵解	增加
寡霉素*	ATP合酶复合物V	增加
2-DG#	糖酵解	减少

*  寡霉素是寡霉素A，B & C的混合物，寡霉素A的含量》60%。

#  2-DG可能看起来清澈，不透明（白色），或白色固体和清澈液体的混合。外观不影响性能。

词汇表

• 糖酵解：葡萄糖转变成丙酮酸的过程。XF糖酵解压力测试将糖酵解的测量表示为细胞加入饱和浓度的葡萄糖后所达到的ECAR速率。

• 糖酵解能力：测量的是加入寡霉素后细胞达到的最大ECAR速率，寡霉素有效关闭氧化磷酸化并驱使细胞利用糖酵解达到最大能力。

• 糖酵解储备：该测量表示细胞响应能量需求的能力及细胞糖酵解功能与理论最大值的接近程度。

• 非糖酵解的酸化：测量其他来源的细胞外酸化，而不是来自糖酵解。

2、试剂盒的信息

试剂盒内容：

Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒包含6个箔袋。每袋包含的试剂足够在一块完整的96或24孔XF细胞培养微孔板上进行一次实验。每袋包含一管以下化合物：葡萄糖，寡霉素和2-DG。见表2。

表2 安捷伦SeahorseXF糖酵解压力测试试剂盒内容。

化合物	盖子颜色	每管的量
葡萄糖	蓝色	300 μmol
寡霉素	浅蓝色	72 nmol
2-DG	绿色	1500 μmol

试剂盒运输和储存：

 产品在室温运输，室温保存。

额外所需的物品：

  以下物品也是进行SeahorseXF糖酵解压力测试所需要的。试剂盒不提供。

表3   额外所需的物品。

物品	供应商	目录号
安捷伦Seahorse XFe/XF分析仪	Agilent	/
对于XFe/XF96机型： XFe96 FluxPak min或XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100或102416-100
对于XFe24机型： XFe24 FluxPakmini或XFe24FluxPak	Agilent	102342-100或102340-100
XF基础培养基（500 mL或2 L）*	Agilent	103334-100或102353-100
XF 200 mM谷氨酰胺溶液	Agilent	103579-100

*  如果需要完整的所有培养基类型和我们对于每种实验试剂盒的推荐清单，请参考SeahorseXF培养基选择指南。

http://www.agilent.com/cs/library/selectionguide/public/5991-7878EN.pdf

推荐使用窄的p1000移液枪头来溶解试剂盒管子中的化合物（例如，Fisherbrand™SureOne™ Micropoint Pipet Tips，目录号#：02-707-402）

3、实验工作流程

图3  安捷伦SeahorseXF糖酵解压力测试实验工作流程。

实验前一天：

1  打开SeahorseXFe/XF分析仪，让其升温至稳定。

2  用适当的细胞生长培养基将细胞以预先确定的密度接种到SeahorseXF微孔板中。（如果需要更多信息，参考基本步骤：SeedingCells in Seahorse XF Culture Microplates，位于  https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/how-to-run-an-assay）

3  在37℃无CO₂培养箱中用SeahorseXF校准液过夜水化一块传感器探针板。（参考基本步骤：Hydratingthe Sensor Cartridge，位于https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/how-to-run-an-assay）

4  在Wave里设计实验。访问https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software

实验当天：

准备检测液

1、往SeahorseXF基础培养基补充添加剂准备检测液。安捷伦Seahorse推荐2 mM谷氨酰胺作为起始条件；然而，需要的培养基组分可以根据细胞类型或体外培养条件而改变。

2、加热检测液到37℃。

3、用0.1 N的NaOH调pH到7.4（注意：安捷伦Seahorse推荐调节pH后过滤除菌）。

4、保持在37℃直到准备使用。

准备化合物储液和工作液

重要：  使用当天配制的化合物。不要再冻存。丢弃任何剩余的化合物。

1、Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒包含：

• 6个箔袋，每袋含有寡霉素

• 6小瓶葡萄糖

• 6小瓶2-DG

试剂盒的试剂足够用96或24孔Seahorse XF细胞培养微孔板做6次完整的XF糖酵解压力测试。

2、从试剂盒中打开一个装有寡霉素（浅蓝色盖子）的箔袋并取出一小瓶葡萄糖（蓝色盖子）和一小瓶2-DG（绿色盖子）。

3、 用p1000移液器，将准备好的检测液以表4所示的体积重悬每种组分。轻轻地上下吹吸（~10次）溶解化合物。涡旋振荡2-DG以确保完全溶解。

图4 移除试剂盖

戴手套的手握住管子，拇指沿着盖子向前滚动来松开盖子，或使用提供的开盖器，把开盖器的尖部插入盖子的内边缘轻轻向后旋转这个工具。

表4  配制储液。

化合物	检测液体积	储液浓度
葡萄糖	3000 μL	100 mM
寡霉素	720 μL	100 μM
2-DG	3000 μL	500 mM

准备加入探针板加药孔中得化合物

有两中探针板加药的方法：

• 固定加样体积/不同化合物浓度

  这种方法以固定体积的化合物加入每个加药孔，要求每种化合物以不同的浓度配制

• 固定化合物浓度/不同加样体积

  这种方法以固定的浓度配制化合物，要求每种化合物以不同的体积加入加药孔

  
  

  表5和表6描述如何用这两种方法在探针板上加样。如果使用固定体积的方法，检测液可以直接加到葡萄糖的瓶子。如果使用固定浓度的方法，不需要额外的检测液。对于寡霉素（两种加样方式任选其一）吸取一定体积的储液到一个圆锥管并加入指定体积的检测液。如果进行的是标准实验，2-DG不需要再添加检测液。

  
  

表5   加到探针板加药孔中的化合物配制（XFe/XF96机型)。

安捷伦XFe/XF96	固定体积
	细胞孔起始体积：175 μL检测液
	(细胞孔孔终浓度)mM	储液体积(μL)	检测液体积(μL)	8X(加药孔)(mM)	加入加药孔的体积(μL)
加药孔A 葡萄糖	10	3000	750	80	25
加药孔B 寡霉素	1.0	270	2730	9	25
加药孔C 2-DG	50	3000	0	500	25

安捷伦XFe/XF96	固定浓度
	细胞孔起始体积：180 μL检测液
	(细胞孔孔终浓度)(mM)	储液体积(μL)	检测液体积(μL)	10X(加药孔)(mM)	加入加药孔的体积(μL)
加药孔A 葡萄糖	10	3000	0	100	20
加药孔B 寡霉素	1.0	300	2700	10	22
加药孔C 2-DG	50	3000	0	500	25

表6  加到探针板加药孔中的化合物配制（XFe/XF24机型）。

安捷伦XFe/XF24	固定体积
	细胞孔起始体积：525μL检测液
	(细胞孔孔终浓度)(mM)	储液体积(μL)	检测液体积(μL)	8X(加药孔)(mM)	加入加药孔的体积(μL)
加药孔A 葡萄糖	10	3000	750	80	75
加药孔B 寡霉素	1.0	270	2730	9	75
加药孔C 2-DG	50	3000	0	500	75

安捷伦XFe/XF96	固定浓度
	细胞孔起始体积：500 μL检测液
	(细胞孔孔终浓度)(mM)	储液体积(μL)	检测液体积(μL)	10X(加药孔)(mM)	加入加药孔的体积(μL)
加药孔A 葡萄糖	10	3000	0	100	56
加药孔B 寡霉素	1.0	300	2700	10	62
加药孔C 2-DG	50	3000	0	500	69

安捷伦Seahorse推荐1 μM的寡霉素；然而，对于特定的样本条件如有必要浓度是可变的。

将化合物加入探针板加药孔中

• 标准实验-没有额外的注射：把化合物加入已水化的探针板上适当的加药孔中：

加药孔A：葡萄糖

加药孔B：寡霉素

加药孔C：2-DG

• 诱导实验-包含额外的注射：在葡萄糖之前注射一种额外的化合物，使用加药孔A注射这种化合物，然后加入：

加药孔B：葡萄糖

加药孔C：寡霉素

加药孔D：2-DG

表7 列出了这种加药方案适合的体积和浓度。

表7   急性注射化合物的注射体积。

	安捷伦 XFe/XF 96分析仪				安捷伦 XFe/XF 24分析仪
加药孔	固定体积 细胞孔起始体积： 175μL检测液		固定浓度 细胞孔起始体积： 180μL检测液		固定体积 细胞孔起始体积： 525μL检测液		固定浓度 细胞孔起始体积： 500μL检测液
A	25μL	8X	20μL	10X	75μL	8X	56μL	10X
B	25μL	9X	22μL	10X	75μL	9X	62μL	10X
C	25μL	10X	25μL	10X	75μL	10X	69μL	10X
D	25μL	11X	27μL	10X	75μL	11X	76μL	10X

准备seahorse XF细胞培养微孔板

1、从37℃ CO₂培养箱中取出细胞培养微孔板，并在显微镜下检查细胞以确认汇合度

2、从水浴中取出检测液。

3、使用多通道移液器，将细胞生长培养基换成温热的检测液，然后把细胞培养微孔板放入37℃无CO₂培养箱45分钟到1个小时。

运行Seahorse XF糖酵解压力测试

打开软件并检索您保存的实验模板文件。对于特定的软件，请遵照以下说明。

如果您使用XF软件

1、浏览并打开保存的设计文件然后点击Run。

2、把水化板和已加药的探针板放在仪器托盘上。校准大约需要15-30分钟。

     注意  移除探针板盖子并确认正确的板放置方向

3、当提示出现时，用细胞培养微孔板替换水化板然后点击Start。

     注意  移除细胞板盖子并确认正确的板放置方向

 如果您使用Wave

1、浏览并打开保存的设计文件，选择Reviewand Run标签，然后点击StartRun。

2、当提示出现时，把已加药的探针板和水化板放入仪器，然后点击I’mready。

校准大约需要15-30分钟。

    注意  移除探针板盖子并确认正确的板放置方向

3、校准结束后，当提示出现时，点击I’mready。加载细胞培养微孔板，点击I’mready以运行实验。

    注意  移除细胞板盖子并确认正确的板放置方向

数据分析

Seahorse XF糖酵解压力测试报告生成器将Wave导出到Excel的数据自动计算Seahorse XF糖酵解压力测试的参数。SeahorseXF糖酵解压力测试报告生成器既可用于标准的压力测试，也可用于诱导的压力测试，提供一份方便，定制化，单页的实验总结。

SeahorseXF报告生成器可以与Wave一起安装，也可以从安捷伦细胞分析网页直接下载。访问www.agilent.com/en-us/support/cell-analysis-(seahorse)/seahorse-xf-report-generators以学习更多关于Seahorse XF糖酵解压力报告生成器的信息和下载用户指南。

声明：仅供研究使用，不用于诊断性操作。

版权说明：本中文用户手册来源于安捷伦细胞分析团队，仅供参考，如有疑问请联系我们微信号13636671781，获取相关须知。

了解更多信息，请联系Agilent 技术热线：800-820-3278 ， 400-820-3278（手机）