Seahorse实验曲线异常原因解答- 大数跨境

首页

Seahorse实验曲线异常原因解答

赛哲科技

2020-05-22

导读：Seahorse实验曲线异常原因解答

为什么我的实验结果曲线很奇怪？

1. 细胞本身的特殊性。

（先问是不是，再问为什么。此因素与Seahorse实验操作无关。）

1.1 细胞本身代谢率很低，导致读值低于量程。

【判断特征】测量值极低（接近背景信号）。常见于部分正常组织的原代细胞，而平常培养的癌细胞系或代谢旺盛的原代细胞（如肝脏、肌肉组织细胞）一般不考虑这种可能性。

【解决方案】1)在细胞板面积允许的情况下，适当增加接种密度（如单个免疫细胞代谢率较低，与正常细胞相比一般需接种两倍以上的量，每孔2×10⁴以上）；2) 保证原代细胞分离质量。

1.2 细胞状态不佳。

【判断特征】非线粒体氧化（non-mito respiration）虚高（占基础OCR的一半或以上）；对药物反应较差；参考文献中的正常数值；镜检，根据日常培养经验判断。（另见2.1）

【解决方案】准备状态良好的细胞，保证合适的密度。

1.3 贴壁性差，换液或实验过程中脱落。

【判断特征】在同一次injection的几个测量点间出现诡异的波动（即在Mix过程中脱落）；读值远低于相应密度细胞的预期值。实验前后镜检即可发现。

【解决方案】1)用试剂提前处理板底，辅助贴壁（见Q5）；2) 减少换液次数（仅直接冲击一次板底），或在每步换液过程中留30μl以上的培养液。一般而言，轻柔的操作对细胞脱落情况的改善十分有限。

2 细胞密度不合适。

1.1 细胞密度过低。

参考1.1，但镜下可明显看见细胞汇合度过低。

1.2 细胞密度过高。

【判断特征】1)整体呼吸偏高（正常癌细胞系basal OCR＞200pmol/min）；2) oligomycin抑制较弱（作用缓慢，或抑制后回升）；3) 非线粒体氧化（non-mito respiration）虚高（同1.2）；4) 镜检可发现。

【解决方案】适当降低接种密度（以糖酵解测试为例，一般让OCR<160pmol/min为宜）；使用过量的oligomycin和A/R浓度。

【小贴士】若同一板中有反应正常的组别，则可基本排除后面上机实验出错的可能性，仅考虑1、2两点即可。

3 上机实验操作有误。

3.1 加药失败。

【判断特征】测量值正常，但是曲线很平，对injection没有反应；或者反应异常，药物的抑制或诱导滞后或不能维持（浓度不够）。

【解决方案】细心加药，完成后在侧面检查药物是否加入。【提醒】一个常见错误是未将所有孔加上等量的液体（见Q3）。

3.2 背景孔异常：1) 将有细胞的孔误设为背景孔；2) 背景孔溶液不在零点或异常波动。

【判断特征】取消勾选Background correction后，曲线变得相对正常。

【解决方案】1) 尝试取消勾选Backgroundcorrection；2) 重做，注意标注背景孔。

3.3 未正确设置Injection程序。

【判断特征】结果界面未显示正确的Injection；实验后药物仍然悬在探针板的Port上。

【解决方案】添加Injection时保证在上一个步骤后面点击，运行前检查程序设置（尤其是Injection顺序）。

3.4 药物提前漏入探针孔中。

【判断特征】读值从第一个点开始逐渐下降（oligomycin、A/R或2-DG漏入）。

【解决方案】探针板加药后，请勿拍打、剧烈磕碰或震荡（此错误不常见）。

4. 试剂配制有问题。

4.1 药物浓度错误。

【判断特征】oligomycin、A/R或2-DG不能彻底抑制（幅度小，作用缓慢，或抑制后回升）；FCCP反应较差：缓慢爬升（低于最适浓度），诱导后迅速下降（高于最适浓度）；某一个药物完全没有反应，其他药物反应正常。

【解决方案】专心计算和配制溶液，保证正确加入；对较密的细胞使用过量的药物浓度。

【小贴士】在边缘设置不加药的对照孔，用以区分自己的药物配制加入与机器打药程序运行导致的错误。

4.2 培养液或药物pH有问题。

【判断特征】通过培养液的颜色判断（偏黄偏紫）；选择ECAR，将左上角Y1处切换至Level后，发现pH值明显偏离6.5~7.4，或在加药后有异常波动（通常仅出现于自己配制的非常规药物的加入）。

【解决方案】提前调好溶液的pH，培养液调至7.4±0.05，药物溶液调至7.1~7.4之间（注意是终溶液而不是试剂储液的pH，可利用边缘孔进行预实验）。

5. 超过检测量程。

【判断特征】OCR高于650pmol/min，OCR逐步下降；将左上角Y1处切换至Level后，发现测量点的溶氧量（O2(mmHg)）降到25以下，后几个点趋于平缓，即孔内微室氧气耗竭。

【解决方案】一般的细胞系即使长满也不会出现这种情况，常见于呼吸值特别高的细胞加完FCCP后（如肝脏原代细胞）。

希望大家可以根据上述的判断特征，按图索骥，找到实验的问题并进行优化。

【声明】内容源于网络

赛哲科技

公司专业从事科研试剂、耗材、仪器的销售及科研项目服务。作为各类欧美实验室试剂、仪器的代理商和国内多家实验室的合作伙伴，我们可以为客户提供高效、经济的一站式解决方案。

内容 70

粉丝 0

赛哲科技公司专业从事科研试剂、耗材、仪器的销售及科研项目服务。作为各类欧美实验室试剂、仪器的代理商和国内多家实验室的合作伙伴，我们可以为客户提供高效、经济的一站式解决方案。

总阅读211

粉丝0

内容70