蛋白-蛋白互作神器：CO-IP以及MS鉴定-全套搞定！

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样本裂解后，孵育诱饵蛋白抗体，抗体捕获样本中的诱饵蛋白，再与protein A/G beads孵育，将“抗体-诱饵蛋白-互作蛋白”一起“共沉淀”到Beads上。洗掉未结合的蛋白后，再将“诱饵蛋白-互作蛋白”从Beads上洗脱下来，得到Co-IP洗脱液，该洗脱液既可用于Western Blot检测（验证已知结合蛋白），也可用于质谱鉴定（筛选未知结合蛋白）。

图1 内源性蛋白Co-IP实验原理图

实验步骤

实验大致流程：总蛋白提取→Input样品制备→总蛋白与抗体孵育→proteinA/G磁珠与抗体结合→蛋白洗脱→WB检测是否存在靶蛋白/质谱鉴定洗脱液中的蛋白。

1 总蛋白提取

1.1 动物细胞

（1）培养目标细胞，待细胞生长至合适密度，收集细胞；

（2）用预冷PBS缓冲液清洗细胞2-3次，加入300-500 μL预冷的IP裂解缓冲液（辉骏货号为：FI8101），在IP裂解液中预先加入3-5 μL蛋白酶抑制剂（辉骏货号为：FI8105），现用现配；

（3）4℃混匀仪上裂解30 min；

（4）为了更充分裂解，最好冰上超声至溶液基本澄清；如果无超声条件，可置于冰上裂解30 min，期间每10 min涡旋混匀一次，每次5 s；

（5）4℃离心机12000 rpm离心15 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中；

1.2 动物组织

（1）采用预冷的PBS清洗新鲜组织，去除血液等成分；

（2）实验组和对照组分别取0.1-0.2 g干净的组织，用液氮在研钵中充分研磨，随后转移至预冷的新离心管中；

（3）每组加入300-500 μL预冷的IP裂解缓冲液、3-5 μL蛋白酶抑制剂，吹打混匀；

（4）冰上超声破碎至溶液基本澄清；

（5）4℃离心机12000 rpm离心15 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中。

2 Input样品制备

（1）所提蛋白每组各取30 μL，加入1×SDS-PAGE上样缓冲液充分混匀，95℃加热5-10 min；

（2）通过Western Blot实验验证样本中目标蛋白的表达情况。

3 总蛋白与抗体孵育

（1）将余下蛋白样本平分为IP实验组、IP对照组，实验组加入目标蛋白的IP级别抗体，对照组加入Normal IgG抗体（与实验组抗体同源同型）；

（2）4℃孵育4 h或过夜。 

图2 内源性蛋白Co-IP实验分组流程图

4 proteinA/G磁珠与抗体结合

（1）磁珠预处理：每组取25 μL proteinA/G磁珠，加入200 μL漂洗缓冲液，颠倒混匀30次；

（2）放磁力架上静置1 min，弃上清；

（3）重复上述洗涤步骤1次；

（4）向磁珠中加入蛋白样本/抗体复合物，充分混匀，置于4℃混匀仪上孵育2 h；

（5）放磁力架上静置1 min，弃上清，加入500 μL漂洗缓冲液，颠倒混匀30次；

（6）放磁力架上静置1 min，弃上清，重复上述洗涤步骤2次。

5 蛋白洗脱

5.1 变性洗脱 （1）向磁珠中加入50 μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液进行洗脱，振荡混匀后瞬离，95℃加热5-10 min；

（2）放磁力架静置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中，进行SDS-PAGE或Western Blot检测，如果需要进行质谱检测，则切胶条后送检。

5.2 非变性洗脱 

（1）向磁珠中加入40-50 µL洗脱缓冲液（辉骏货号为：FI8102），涡旋振荡20 s，放混匀仪上室温洗脱10-15 min，涡旋振荡20 s；

（2）1000 g离心20 s，放磁力架上静置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中；

（3）洗脱后的蛋白-80℃保存，或直接用于SDS-PAGE、Western Blot和质谱等实验。

6 WB检测是否存在靶蛋白/质谱鉴定洗脱液中的蛋白

6.1 WB检测是否存在靶蛋白

通过蛋白印迹(Western Blot)技术分别使用Anti-Bait和Anti-Prey对沉淀中的蛋白质进行检测，若能够检测在沉淀中同时存在诱饵蛋白和猎物蛋白，则说明这两种蛋白之间存在相互作用。

6.2 质谱鉴定洗脱液中的蛋白

通过质谱（LC-MS/MS）技术对IP洗脱液中的蛋白成分进行鉴定和分析，筛选诱饵蛋白的未知互作蛋白。

Ps：辉骏生物自有质谱检测平台，擅长IP、pull-down产物等微量蛋白的质谱鉴定及生信分析。

实验注意事项

1.保证加入蛋白酶抑制剂，实验需在冰上操作，避免蛋白出现降解；

2.选择合适的IP级别抗体，最好是单抗；

3.使用合适的洗脱液，保证洗脱液的强度和PH值合适；

4.清洗次数会影响最终结果，清洗次数过多会导致弱结合蛋白被洗脱，检测信号弱；清洗次数过低会导致非特异性结合未被清洗干净，信噪比高；

5.抗体和beads为非共价结合，会一同被洗脱，产生“抗体轻重链”污染。

实验结果

Input组：利用Anti-Bait、Anti-Prey对样本裂解液进行WB检测，验证Input中是否存在Bait、Prey，从而确定蛋白的表达情况以及抗体效果；

IgG组(阴性对照组)：排除非特异性结合的干扰，normal IgG不能富集Bait，一般不会有Bait条带，如果有条带说明Bait与beads或IgG有非特异性结合，需要重新完善下方法；

IP组(实验组)：Anti-Bait可以特异性富集Bait，所以一定会有Bait条带，没有条带说明IP实验失败，需要复核IP流程，或检查Anti-Bait是否可以用于IP实验；如果IP洗脱液中也能检测到Prey，说明Bait和Prey存在相互作用。

图3 内源性蛋白Co-IP实验结果解析图

内源性Co-IP实验验证两个已知蛋白（Bait和Prey）是否存在相互作用，如果最终的结果均有条带，则可以证明两个蛋白之间存在相互关系，上图为IP阳性结果示意图：表明Bait可以与Prey结合，存在相互作用。

后续MS结果可以做定性或者定量分析：

HTML分为三部分：整体质控及参数信息；蛋白定性列表；各个蛋白详细定性列表；

整体质控分为以下内容：

假发现率 FDR

概念：FDR主要用于实验数据较为复杂时的质控。理想的FDR曲线在接近1%FDR时平滑上升，且number of peptides-spectrum matches数值理想，表明该次鉴定结果可信且数量理想。对于小规模实验，如几个到几十个蛋白的鉴定，该曲线不具备参考价值。

内容说明：横坐标为实验中谱图匹配上肽段（PSM）信息的数量，纵坐标为相应的FDR值。竖虚线与蓝色曲线交点为相应FDR设置值下的PSM大致数量。FDR一般取1%，如上图，相应FDR-PSM曲线越靠近横坐标较大值时越陡峭上升，表明高可信的鉴定谱图相对越多。小规模实验一般不卡FDR阈值而采用-10lgP进行筛选，一般选大于20分的结果报告。

得分分布Score distribution

概念：score针对的是每张匹配到肽段的谱图与该肽段理论碎裂谱峰之间相似性高低的一个评价体系，一般来说score越高，证明该谱图与理论谱图越一致，信噪比一般也是越好。

内容说明：图a是谱图质量score与相应谱图数量的分布图，一般20分以上的蓝色柱状图分布越多表明高质量谱图的结果占比越高。

图b是质量得分与仪器质量精确度分布得分，可以从大多数蓝色点分布在2.5ppm范围内，说明质谱仪器检测精度极高且稳定。

注：棕色点为错误结果得分，其分布越靠近x轴0点，表明结果质量越好。

肽段特征检测结果 

概念：蛋白质鉴定会因为所选的数据库不合适或者样品被非预期的物种蛋白污染而导致鉴定率不佳。经验较少的研究者就无从判断该如何去解决这个问题。PEAKS采用feature detection特征峰识别结合De novo策略评判，数据库匹配的谱图和无法匹配数据库但谱图本身碎片离子信息丰富而能够de novo的结果区分开。De novo及特征峰识别原理请参见后续资料。我们可以简单认为每个特征（feature）代表进入质谱并成功形成一个离子流谱峰的物质。该物质可以是一个肽段，也可能是一个污染物。

内容说明：图a和图b分别以质核比m/z和保留时间为X轴，相应的特征数量为柱状图展示的特征峰数量分布。橙色分布为常规数据库定性匹配的结果，青色为De novo+数据库搜索的结果（橙色部分被青色所包含），纯青色部分即为仅通过De Novo算法匹配的肽段，深蓝色部分为识别成功的特征峰但没有得到任何匹配（可以是没有任何结果，也可以是有匹配结果但质控不合格，-logP<20, Denovo confidence<50%）。如果a b图蓝色结果（没有被成功搜库鉴定）远多于青色+橙色部分，则说明谱图利用率较差，怀疑质谱状态不佳或样品受到较严重的污染，如果青色部分比例较高，可以怀疑是否是因为数据库选择不佳或者有其他物种蛋白污染。

鉴定成功肽段结果分布

在经过De Novo和数据库检索后，检索结果可以分为以下两类： 

Verifiable de novo sequences

可验证的de novo序列:亦即是De Novo结果和数据库检索的可信结果可以互相验证。而其中de Novo可信的氨基酸就会记录为Reference残基。 

"De novo only"序列

如果某个MS/MS谱图数据库检索没有得到可信结果而de novo检测认为可信，则该谱图被标记为"De novo only"。 "De novo only"的序列可以认为是全新肽段、未知修饰肽或其他有意思的分子。

结果解读：如果MS/MS谱图无法被数据库检索成功匹配，那么该谱图的De Novo检测可靠性可以通过peaks统计预估。通过将本次分析中的De Novo结果和数据库检索结果进行比较，Peaks能够计算出其预期的准确率，并得出上图的（b）结果，您可以通过该曲线预判De Novo结果的置信度，比如上图希望得到90%以上的accuracy，那么相应的de novo score需要98以上。

质量精度质控

概念：质谱检测蛋白及多肽的基本原理之一就是将质谱仪器检测到的多肽分子量和数据库中分子量非常接近多肽进行比较，并进一步筛选碎片离子的相关性获得准确的氨基酸序列组成。因此质谱检测多肽的分辨率和稳定性对结果分析的准确性至关重要！目前高精度质谱的肽段分子量检测分辨率可以达到3-7ppm，而同时分子量检测的偏移程度一般也不超过2ppm。如果质谱仪器维护不佳导致会导致检测稳定性不佳，使得上图a的分布明显偏离0ppm，如果质谱仪器分辨率不佳，会导致上图a的分布峰宽超过7~10ppm，这样会使得最终检测的精度和准确性变差。理想的高分辨质谱应该可以达到图a中的分布95%峰宽在+-5~7ppm以内，而峰中心分布应该在0+-2~5ppm以内。这样整体的分布应该不超过+-10ppm。

内容说明：A图横坐标为质谱检测到的分子量与数据库匹配多肽结果的实际分子量间差异的百万分之一偏差（ppm）数量分布，纵坐标为相应的匹配结果数量，可以看到大部分结果都落在-3~3ppm之间，表明质谱质量轴稳定，质量精度非常高。B图为质量精度与检测到的肽段核质比分布图，可以看到随着肽段分子量变大，质量精度略有下降，但依然处于超高精度范围内。

Missed Cleavages

报告了单个实验结果中漏切比例，对于常规定性或定量且采用Trypsin酶切的样品，0漏切应该占80%以上比例，1漏切占15%左右比例，2漏切及更多漏切的结果应该少于5%。特殊蛋白或修饰丰富的蛋白酶切结果不在此经验值考虑范围。

Modifications

概念：报告了搜索时设定的各个翻译后修饰的谱图匹配数量，及该修饰最高AScore得分。我们的分析分两种情况：1.常规检测，不以寻找翻译后修饰为目的的研究，该结果则展示了预设的几种常见修饰如还原烷基化、氧化等的数量；2. 开放性修饰搜索，目的是找到样品中可能存在的较高丰度的各类修饰，PEAKS PTM模块会尝试在数百种可能存在的修饰种类中较高丰度的出现在该样品中的情况。ASCORE则是评估某条肽段如果存在多个可修饰位点时，修饰具体发生在某个位点上的概率，一般大于13我们可以认为该修饰能够较可信的定位的修饰位点。

4.3.2 Excel表详细信息

a)Proteins: 经过前期质控筛选后得到的蛋白列表（筛选了是否显示所有蛋白家族成员、得分、FDR和unique肽数量等） 

b)protein peptides: 经过以上筛选的蛋白所对应的肽段列表，由于同源肽段可能归属于多个蛋白，因此该列表的行数会大于结果报告中的数量。

c)peptide: 经过前期质控筛选后得到的肽段列表。

d)de novo only peptide:在数据库中未检索得到，具有较高可信度的de novo结果的肽段（ALC (%)＞50）列表。

Excel 表格表头说明，

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