CloneSelect 单细胞分离系统用于分选基因编辑的间充质干细胞

最近发表的一篇文章（Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and emulsion coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning），作者用 CRISPR/Cas9 对间充质干细胞（MSC）开展 RANKL 基因敲除以提高其骨骼形成能力。整个实验流程起始于转染，接着用 CloneSelect f.sight 单细胞分离系统开展单细胞克隆，随后在 DNA、RNA 以及蛋白质水平开展分析，最后开展细胞功能分析（图 2）。

作者在 CRISPR/Cas9 基因敲除质粒中加入了 GFP 基因，转染间充质干细胞后，用具备荧光分选功能的 CloneSelect f.sight 系统分选出转染成功的单细胞。系统可设定细胞直径、圆度和荧光强度等指标，分选出单个活细胞并接种至微孔板。图 3 为系统分选基因编辑的间充质干细胞的 5 张连续的图像。

通过浏览单细胞分离过程中记录的 5 张连续的图像，作者统计单细胞接种的成功率为 93.9±2.7 %（n=451），即仅有~ 6 % 的孔为多细胞孔，或空孔或无法确认（图 4）。这一结果表明 f.sight 单细胞分离系统可以准确地识别细胞并成功将其接种至微孔内。

除了带 GFP 的基因敲除质粒外，作者还将 pmaxGFP 质粒转染至间充质干细胞作为对照用于评估单细胞分离效率和克隆率。此外，作者转染了多个不同的基因敲除质粒。虽然不同的质粒因为大小不同而呈现各异的转染效率，但是成克隆率都达到了 30 %。此外，作者还发现转染质粒的间充质干细胞（31.3±8 %）和未转染的间充质干细胞（39.6±15.6 %）在成克隆率上差异较小，这也表明 f.sight 的单细胞分选过程柔和，因此产生的系统偏差较小（图 4）。

接着作者采用 surveyor assay、RT-PCR 和 emulsion coupling 分别从 DNA、RNA 和蛋白质水平对基因编辑后的间充质单细胞开展分析。最后作者选出一株双等位基因敲除的间充质干细胞（g23d）检测其成骨分化的能力，并以未编辑的 MSC 为对照开展平行实验。细胞转移到成骨分化培养基后，分别在第 7 天、14 天和 21 天用茜素红染色。在第 14 天，细胞失去细长的成纤维细胞样形态，开始呈现出成骨细胞样的形态，然后在第 21 天开始出现钙沉积，发展过程与亲本的 MSC 对照类似（图 5）。这表明基因编辑后的 MSC 其成骨分化能力并没有因为基因编辑和筛选过程而受到影响。