昼夜节律作为一种内源性自由运转的周期性循环，以大约 24 小时为一周期。环境因素会对昼夜节律产生影响，从而使生物体在生理和行为上发生改变以适应环境[1]。对于哺乳动物而言，这些节律由下丘脑视交叉上核中的光牵引主起搏器协调[2]。对跨多个器官系统的昼夜节律调节基因进行对比的结果表明，几乎一半的蛋白质编码基因可以在不同组织中以昼夜方式进行调节[3]。这种组织特异性的昼夜节律基因表达调节对个体器官功能在昼夜节律周期内的维持和动态变化至关重要。
衰老的特征之一是对抵御感染和炎症性疾病恶化的能力愈加脆弱，例如动脉粥样硬化、癌症和神经退行性疾病等。来自斯坦福大学和宾夕法尼亚大学的研究人员近日在 Nature Immunology 杂志上发表文章，该团队发现衰老与昼夜节律性先天免疫反应的丧失有关，包括从骨髓到血液的单核细胞运输、对脂多糖的反应和吞噬作用，这种机制可能是以随年龄增长而导致保护性免疫反应逐渐丧失的基础。
研究人员发现衰老消除了小鼠体内的昼夜先天免疫反应。该团队首先研究了 Ly6Chi 炎性单核细胞从骨髓到血液的昼夜性运输，这是一种对抗菌免疫防御至关重要的稳态骨髓过程[4]。他们分别从 2 - 3 月年龄和 18 - 20 月年龄的小鼠中提取血单核细胞、骨髓巨噬细胞和脾脏巨噬细胞，并使用流式细胞荧光分选技术作细胞丰度定量。年轻小鼠中提取的 Ly6Chi 单核细胞表现出从骨髓到血液的强劲昼夜节律和在巨噬细胞的脾丰度中的亚昼夜节律，然而血液和骨髓中单核细胞和巨噬细胞的昼夜节律性在老年小鼠中完全丧失。
其次，鉴于骨髓细胞在协调针对病原体的免疫反应中的重要性，该团队接下来检测了响应脂多糖（一种典型的细菌抗原）刺激的昼夜节律变化。实验发现，在授时因子时间为 0 时注射脂多糖的年轻小鼠存活率显著高于在授时因子时间为 12 时注射脂多糖的年轻小鼠，然而在年老小鼠之间没有显著区别。
最后该团队比较了年轻和老年的原发性腹膜巨噬细胞在 24 小时内每 4 小时吞噬荧光大肠杆菌颗粒的能力。年轻巨噬细胞在 24 小时内表现出强烈的节律性吞噬活动趋势，在黑暗阶段开始时吞噬活动达到峰值，这种昼夜变化在衰老的巨噬细胞中完全消失了。这些结果共同表明骨髓细胞运输、全身性脂多糖反应和巨噬细胞介导的细菌吞噬作用的昼夜节律性随着衰老而丧失。细菌吞噬实验使用 Molecular Devices 公司的 SpectraMax M2e 酶标仪使用荧光底读模式进行荧光强度读数，激发光波长为 480nm，发射光波长为 520nm。
为了更好地理解衰老引起昼夜节律丢失的分子机制，研究人员采用了无偏转录组学的方法，并比较了年轻和年老小鼠体内腹膜巨噬细胞的昼夜节律情况。RNA-seq、JTK_CYCLE 分析[5]和 CLEAR Network 分析方法得出的结果证实衰老过程中巨噬细胞包括吞噬作用相关基因节律性转录的严重缺失，但是核心分子时钟并不受此影响。染色质转座酶可及性测序（ATAC-seq）的结果也证实染色质结构与节律性转录缺失无直接相关性。
鉴于此前的实验结果都没有为老年巨噬细胞的昼夜节律转录重编程提供原理上的解释，研究人员猜想可能转录因子的差异结合可以调节与年龄相关的转录本振荡损失。
（1）年轻和年老巨噬细胞之间的染色质差异
（2）与在两个年龄组之间显示不同振荡模式的基因的差异结合和
（3）在衰老巨噬细胞中丢失的转录因子的节律性表达，最终筛选到唯一符合这三个条件的转录因子，含锌指的 KLF4
KLF4 此前曾被广泛报道参与细胞分化和干细胞重编程的过程。该团队首次发现，KLF4 不仅与差异染色质可及性和与节律基因的差异结合作用相关，而且在衰老细胞中缺失却能在年轻巨噬细胞中显示出振荡表达。该性质在众多转录因子甚至是 KLF 基因家族中都是独一无二的。体内和体外的基因敲除实验表明 KLF4 是一种生物钟控制基因，可调节吞噬作用的昼夜节律。另外通过对比 KLF4 和其 rs2236599 突变型可以发现，突变型表现出对细菌感染易感性的升高，而且 KLF4 突变型在年轻人和老年人之间的易感性差异较小。这些都揭示出 KLF4 和人体先天免疫功能之间的关联性，并且该过程可能受年龄影响。
总而言之，该团队首次报道了随着年龄的增长巨噬细胞功能的昼夜节律性和巨噬细胞转录反应会产生显著的破坏。免疫系统的细胞，尤其是巨噬细胞，可能会随着衰老而受到更多细胞外在因素的影响，这可能会破坏原本协调的免疫基因表达，导致与年龄相关的昼夜和稳态免疫功能失调。该团队还确定了 KLF4 作为衰老巨噬细胞中平衡昼夜节律作用的细胞内在调节剂的新作用。
参考文献：
[1] Bhadra U, Thakkar N, Das P, et al. Evolution of circadian rhythms: from bacteria to human[J]. Sleep Medicine, 2017, 35: 49-61.
[2] Blacher E, Tsai C, Litichevskiy L, et al. Aging disrupts circadian gene regulation and function in macrophages[J]. Nature immunology, 2022, 23(2): 229-236.
[3] Zhang R, Lahens N F, Ballance H I, et al. A circadian gene expression atlas in mammals: implications for biology and medicine[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111(45): 16219-16224.
[4] Nguyen K D, Fentress S J, Qiu Y, et al. Circadian gene Bmal1 regulates diurnal oscillations of Ly6Chi inflammatory monocytes[J]. Science, 2013, 341(6153): 1483-1488.
[5] Hughes M E, Hogenesch J B, Kornacker K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets[J]. Journal of biological rhythms, 2010, 25(5): 372-380.
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