我们已知 TNFα（肿瘤坏死因子 α）是一种涉及到系统性炎症的细胞因子，同时也是属于引起急相反应的众多细胞因子中的一员。目前已知 TNFα 是目前市场价值较高的生物药靶点之一，相关的原研生物药近十年来的销售总额持续增长，尤其是 TNFα 抑制剂研究进入高速增长阶段。TNFα 主要由巨噬细胞分泌，TNFα 生产的失调被认为与许多人类疾病有关，包括阿兹海默氏症、癌症、重性抑郁障碍、风湿性疾病及肠炎等。现在目前已知 TNFα 由巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、 CD4 +T 细胞及 NK 细胞分泌获得。
巨噬细胞是一种白细胞，在检测和去除传染性强的微生物，去除死细胞和碎片及伤口愈合发挥着重要作用。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境的主要细胞组成部分，通常与愈后不良有关。目前的人类单核细胞系 THP-1 来源于急性单核细胞白血病患者的血液，被广泛用于研究单核细胞和巨噬细胞的功能，癌症和免疫学的研究，通常 THP-1 细胞以悬浮形式生长，但当使用佛波醇（PMA） 和脂多糖 （LPS）处理时，它们可被诱导分化成贴壁巨噬细胞样细胞分泌 IL-8、TNFα 和其他标记物 ，因此可以作为人类巨噬细胞生物学的模型细胞系。
高通量灵敏检测方法越来越被药物靶点研究客户所青睐，通过使用非常灵敏的可定量检测化学方法的标记物检测 TNFα 表达水平的方法，人们可以探索所涉及的细胞信号传导途径，并探索那些有效成分化合物可以减少 TNFα 分泌。
背景
这篇应用文章中，通过 THP-1 分化的巨噬细胞使用 AlphaLISA 高性能 （HP） TNFα 检测试剂盒，我们评价几种已知的常见的抗炎化合物的效果，看一下如何通过具有成像功能的高性能微孔板检测系统检测和进行数据分析。
这里我们使用 SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机进行这种高通量的均相检测，在去除培养基的经 PMA 和 LPS 激活的 THP-1 细胞中检测到皮克水平级别 TNFα 表达水平，并进一步对使用化合物 SB202190 和白藜芦醇进行处理。使用 SpectraMax i3x 多功能读板机进行高通量的均相检测，在用 PMA 和 LPS 激活 THP-1 细胞后，再用 SB202190、Static 和白藜芦醇处理 THP-1 细胞，在培养液中检测到皮克级别 TNFα 的表达水平。
材料
SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机（Molecular Devices P/N i3x）
AlphaScreen 检测卡盒（384 HTS）（Molecular Devices P/N 0200-7018POS）
AlphaLISA 高性能（HP）人肿瘤坏死因子 α （TNFα） 检测试剂盒，500 次检测点（Perkin Elmer 商品目录号 #AL3157C）
SpectraMax i3x 专用的 MiniMax 细胞成像系统
THP-1 细胞（ATCC 目录 #TIB-202）
脂多糖（LPS，Sigma 商品目录号 #L2630）
SB202190（Sigma 目录 #S7067）
白藜芦醇（Sigma 目录 #554325）
Stattic（Sigma 目录 #S7947）
96 孔黑色透明底细胞培养微孔板（康宁 #3603）
白色实心、低容量 384 孔微孔板（康宁 #4513）
Phorbol 12- 肉豆蔻酸 13- 醋酸酯（PMA，Sigma 产品目录 #524400）
步骤
1
第 1-2 天：THP-1 细胞以 20,000 个细胞/孔，用 96 孔细胞培养微孔板处理 20 ng/mL PMA 诱导分化 48 小时。细胞在第 1 天和第 2 天在 MiniMax 成像系统上拍摄形态变化。
2
第 3 天：在 MiniMax 成像检测前可先对细胞进行清洗，以直观地评估其分化。细胞洗涤后在不含 PMA 的培养基中孵育 24 小时。
3
第 4-6 天：化合物 SB202190、Stattic 和白藜芦醇起始浓度为 100 μM，培养基中按 1:3 稀释至 0.002 μM（共 11 个浓度）。化合物后两小时添加 LPS，以最终浓度加入细胞中 1 μg/mL 以诱导炎症反应 48 小时，几个经 PMA 处理的对照细胞孔未接受。
4
在第 6 天，处理过的培养基的等分试样和对照细胞孔从孔中移除，使用 AlphaLISA 试剂盒检测 TNFα 表达。
TNFα AlphaLISA 检测
参考检测试剂盒的技术参数设置，便于进行试剂制备和标准设置，最后通过获得曲线回算分析样品浓度。在这里概述方案（两个孵育步骤），技术数据表中使用了与替代检测方法相比，检测灵敏度更高。由 TNFα 标准品组成的 12 点标准曲线从 0.3 pg/mL 至 100 ng/mL，每浓度四个重复孔，低体积白色 384 孔板进行检测。另外 22 个复孔不包含标准，因此可计算 TNFα 的检测限 （LLD）。从每个处理过的细胞孔，4 份等分试样，每份 5 μL 转移至 384 孔检测的四个重复孔中。
5 μL 的 10X 抗 hTNFα 受体微珠混合物（100 μg/mL） 和生物素化抗 hTNFα 抗体 （10 nM）添加到每个检测孔中，在室温下孵育 60 分钟。之后向每个孔中加入 40 μL 1.25X SA 供体微珠，并将板在室温下孵育 30 分钟。然后在 SpectraMax 上读取平板配备 AlphaScreen 检测卡盒的 i3x 读板机（384 HTS），使用表 1 所示的设置。
表 1：AlphaScreen 的 SpectraMax i3x 读板机的仪器设置参数
结果
THP-1 细胞通常以悬浮形式生长，最初接种在 96 孔板中时，它们具有球形外观。然而，在 20 ng/mL PMA 中孵育后，它们开始附着在孔底上，并采用更细长和更平整的外观。到三天处理时，许多细胞已采用这种巨噬细胞样形态（图 1）。
图 1：使用 MiniMax 细胞成像系统对 THP-1 细胞进行成像。在第 1 天，细胞表现出圆形形态。PMA 治疗 24 小时后（第 2 天），观察到延长和扁平的细胞，在第 3 天观察到更多此类细胞（黄色箭头）。
培养基从含有化合物处理的 THP-1 巨噬细胞的孔中移除，并使用 AlphaLISA 检测技术，对 SB202190、Stattic 和白藜芦醇抑制 TNFα 表达呈浓度依赖性。使用 SoftMax Pro 软件中的 4 参数曲线拟合绘制结果，EC 50 值自动计算（图 2）。曲线拟合设置包括计算统计数据的选项，包括一个独立参数，有助于评估给定曲线拟合对数据集的适用性。
图 2：SB202190（红色）、static（绿色）和白藜芦醇（蓝色）对THP -1 源性巨噬细胞 TNFα 抑制作用的观察。
详细信息显示 4 参数曲线拟合，曲线拟合结果表显示独立性参数，该参数被转变成条状显示，其中条数表示独立程度。还显示每种化合物的 EC 50 值。
TNFα 标准曲线（图 3）可计算检测样品中的实际 TNFα 水平。所示曲线展示的是从 61.7 pg/mL 到 100 ng/mL 的检测窗口。AlphaLISA 信号范围完全涵盖来自 TNF α平均范围为 0.47 ng/mL 至 7.70 ng/mL 的处理细胞的样品。
图 3：TNFα 标准 4 参数拟合曲线
结论：
这些结果证明了 AlphaLISA 检测在 SpectraMax i3x 读板机上的高信号窗口及高灵敏度检测。与未受刺激的细胞相比，经 LPS 刺激并经化合物处理的巨噬细胞培养基样品中 TNFα 可定量化检测。该检测的所有 AlphaLISA 信号均落在 TNFα 标准曲线，因此可通过 SoftMax Pro 软件分析获得。
SB202190、Stattic 和白藜芦醇的最高测试浓度可将 TNFα 分泌降低至更低水平，高于在非 LPS 刺激的细胞中观察到的水平。在 SoftMax Pro 中，计算曲线拟合参数的独立性软件用于评估并应用于这些数据集的 ，自动进行 4 参数曲线拟合的拟合优度，EC 50 值等。
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