介 绍
Cav1.3 是一种 L 型电压门控钙通道，是药物发现的重要治疗靶点。有研究表明，一些药物对 Cav1.3 通道产生了状态依赖性的效应[1]，这意味着这些药物的效应随着膜电位的变化 (Vm) 以及随之而来的通道状态的改变（开放、关闭、失活）而发生变化，这可能为病理上过度激活的 Cav1.3 通道提供了选择性。现在，对高通量分析方法的开发需求日益增长，以评估通道阻断剂的不同状态下的效应。
目前的筛选方法采用电生理学或荧光法，利用钾离子来调节膜电位，但两种方法都有很大的局限性。电生理学直接控制 Vm，但它是侵入性的且并不是很适合高通量的检测分析模式，而荧光测定法则具有较差的生理相关性，而且是不可逆的。
为了解决这些局限性，我们将介绍一种新的解决方案，它利用光遗传学方法通过光敏感通道 -2 (channelrhodopsin-2，ChR2)[2] 来控制 Vm。ChR2 是一种光门控机制的非选择性阳离子通道，主要用于通透钠离子 (Na+)。当通过蓝光 (470 nm) 激活时，ChR2 介导 Na+ 的流入，从而延长了膜的去极化，使Cav1.3 通道首先进入开放状态，然后逐渐进入失活状态。在光激活终止后，膜电位再极化，这将使 Cav1.3 通道回到它的静息状态。
在这项研究中，我们将使用 FLIPR 系统展示一种光遗传学方法的新应用来控制 Vm，进行用可逆且精确的方式来筛选状态依赖性钙通道阻断剂。
优 势
通过光的应用，开发出靶向特异性和非侵入性的检测方法
灵活的、可逆的检测方案
数据质量达到电生理以及钾离子刺激等方法检测的标准
材 料
HEK-293 细胞系联合表达 ChR2D156A（来源于莱茵衣藻），人源的 Cav1.3 α1 + α2δ, Β 亚基，以及人源的 Kir2.3。
FLIPR 系统，FLIPR 钙 6 检测试剂盒 (R8190) 和 FLIPR 膜电位检测试剂盒 (R8042) ， 均来自于 Molecular Devices 公司。
方 法
光遗传学的一个强大应用是利用光敏驱动器控制 Vm。在本研究中，C. reinhardtii 的光敏 ChR2 蛋白被用于控制 Vm，作为对状态依赖性 Cav1.3 阻断剂的高通量分析检测的基础。具体地说，ChR2D156A 突变体在 FLIPR 系统上被其 LED 所发出的蓝光 (470 nm) 激活，这使得由于其对 Na+ 的渗透性和开放状态下约为 6.9 分钟的延长的时间常数[3]，导致了一种超强的且被延长的膜去极化。由于 Vm 的去极化，Cav1.3 通道首先打开允许 Ca2+ 离子进入细胞（图 1），并随着时间的推移进入失活状态（图 2）。使用 FLIPR 钙 6 检测试剂盒观察细胞内钙离子的动态变化。
图 1. Kir2.3、Cav1.3 和 ChR2 转染至 HEK-293 细胞上。高 K+ 的应用，或者是对 ChR2 的光刺激对 Vm 进行去极化，从而获得了钙离子通过 Cav1.3 流入胞内。
图 2. 依据 Vm，不同状态下 Cav1.3 的通道周期。当膜电位超极化时，通道处于其“闭合”静息状态。在 Vm 去极化后，通道打开，允许 Ca2+ 离子进入细胞，然后立即进入“未激活”的不应状态。在 Vm 重新极化后，Cav1.3 通道从失活状态恢复，返回到封闭状态，然后准备再次响应 Vm 去极化刺激。
结 果
通过 ChR2 调控 Vm
通过用 FLIPR 膜电位染料孵育 ChR2 转染的 HEK-293 细胞，验证了光激活 ChR2 对膜电位的调控。由 FLIPR 系统 LED 发出的蓝光脉冲导致膜去极化，而 FLIPR 膜电位染料的信号增加了 3 倍（图 3A）。随着时间的推移，膜电位信号的记录显示，当细胞膜重新极化时，从最初的蓝光刺激到大约 30 分钟后，荧光信号返回到背景水平。这一数据表明，当蓝色光刺激 ChR2 打开时，Vm首先被去极化，随着时间的推移，ChR2 通道关闭 Vm 重新极化（图 3B），它的时间常数为 6.9 分钟。
图 3. (A) 光刺激诱导去极化。利用蓝色光将 Vm 的去极化作为 FLIPR 膜电位染料荧光强度改变的定量检测。(B) 时程实验表明随着时间的推移，最大的 FLIPR 膜电位染料信号的变化。ChR2 Cav1.3 HEK -293 细胞用 FLIPR 膜电位染料孵育。通过脉冲蓝光诱导膜去极化，使荧光信号从染料 (T=0) 开始逐步增加。随着时间的推移，荧光结果显示了信号的下降，表明膜的再极化。
ChR2 诱导的 Cav1.3 反应
转染的 HEK-293 细胞与 FLIPR 钙 6 染料孵育。随着钙离子进入细胞（图 4A），蓝色发光二极管发出的光脉冲触发了荧光信号的增加。随后的实验（图 4B）中，使用双脉冲检测方案的细胞来识别 Cav1.3 通道从失活状态恢复的时间依赖性。10 分钟间隔后，记录到了原始钙流一半的信号。45 分钟间隔后，几乎 100% 的信号被记录下来。数据显示，在第一次光脉冲 10 分钟后，一半的通道仍处于失活状态，从而产生 50% 的最大钙信号。
图 4. (A) 在蓝光刺激后，ChR2 诱导的 Cav1.3 反应。从 FLIPR 系统记录的信号中发现，随着钙进入细胞，钙 6 染料的荧光信号增强。(B) 从失活态恢复的 Cav1.3。在这里应用了双脉冲检测方案，在 t=0 处应用了第一个蓝色光脉冲，然后在增加间隔后，细胞获得了第二个脉冲，并测量了钙流信号。数据表明基于半数初始钙流信号的标准，通道的半数激活状态出现于在第一次刺激 10 分钟后第二次光脉冲诱导的信号。
钾离子的调控
用 K+ 调控 Cav1.3 通道的状态，转染 HEK-293 细胞系中加载 FLIPR 钙 6 染在 37 °C下孵育一小时，添加缓冲液增加钾离子浓度从 4 mM 到 75 mM 以形成不同的膜电位 (Vm)。然后在 FLIPR 系统中检测钙信号时添加 75 mM 的高浓度 K+。代表性的钙信号响应如图 5A 所示。K+ 依赖的失活曲线展示了与 K+ 浓度对应的 FLIPR 钙 6 染料信号，数据显示诱发的 50% 最大 Ca2+ 信号的钾离子浓度是 22 mM（图 5B），这表明在添加了此浓度的钾离子条件下有一半的 Cav1.3 通道处于失活状态。
图 5. (A) 加载有 FLIPR 钙 6 染料的细胞在不同的 [K+] 条件诱导产生不同的起始电压。在 FLIPR 系统检测钙信号时添加 75 mM K+。(B) K+ 失活曲线。通过在染料中孵育 22 mM K+ 的细胞，50% 的通道处于失活状态。
药理学
依拉地平是一种抗高血压药物，它也可能有助于减缓帕金森疾病症状的发展，因其对 Cav1.3 的状态依赖性影响而被选为这项研究的对象。采用 ChR2 的光遗传学检测方案，表达了 Cav1.3 的 HEK-293 细胞在添加不同浓度依拉地平的情况下，用 FLIPR 钙 6 染料在 37 °C 下孵育一小时。在 FLIPR 系统上采用蓝色光脉冲进行刺激，检测到通道关闭状态下钙流荧光信号的强度的增加。10 分钟后，给予了第二次蓝色光脉冲刺激，记录到了通道失活状态下钙流荧光信号的变化。仅观察到原始钙流信号一半强度的荧光信号。在图 6A 中，结果显示为 Cav1.3 通道效应的 %。高 K+ 调控方案记录的依拉地平的 IC50 曲线如图 6B 所示。在较早的钾离子调控实验基础上，将 4 mM K+ 或 22 mM K+ 添加到 FLIPR 钙 6 染料的加载缓冲液中，分别诱导关闭和失活状态。在 FLIPR 系统中检测钙信号时添加了 75 mM K+。膜片钳方法下检测的 Cav1.3 通道关闭和失活状态下依拉地平的 IC50 曲线如图 6C 所示。
图 6. 依拉地平 (Isradipine) 状态依赖性对药理学的影响。(A) 光遗传学检测方案。在通道关闭状态下（第一次蓝光刺激），依拉地平的 IC50 = 149 nM。在失活状态下（10分钟后，细胞以蓝光重新刺激），依拉地平的 IC50 = 15nm。(B) 高钾检测方案。在检测过程中添加了 75 mM K+。在 Cav1.3 关闭状态下 (4 mM K+ load)， 依拉地平的 IC50=26 nM。在失活状态下 (22 mM K+ load)，依拉地平的 IC50=4 nM。(C) 膜片钳检测方案。在 Cav1.3 关闭状态下（-90 mV 钳制电位）中，依拉地平的 IC50 = 362 nM，在失活状态（-60 mV 钳制电位）中，依拉地平的 IC50 = 32nm。
总 结
包括膜片钳结果在内的所有 Cav1.3 通道关闭和失活状态下依拉地平的 IC50 值的比较如表 1 所示。与关闭状态下的值相比，所有检测方法下得到的在失活状态下的 IC50 值的左移大约为 10 倍。这很重要，因为对离子通道的复合效应在通道关闭和失活状态下可能具有不同的临床意义。通过光遗传学检测方案，IC50 值更接近于以电生理方法获得的 IC50 值。光遗传学所获得的“阻断比例”值与电生理学方法所获得的值高度相似，从而提示其高生物相关性。与电生理学不同的是，光遗传学检测中的细胞在实验结束时完好无损。此外，光驱动的光遗传检测是可逆的，这是灵活的分析方法的一个非常理想的特性。
表 1. 在通道关闭和失活状态下依拉地平的 IC50 结果总结。光遗传检测方案的结果是最接近电生理和文献的结果。
参考文献
1. Koschak, A., et al, J. Biol. Chem.2001, 276:22100-22106.
2. Prigge, M., Rossler, A., Heggeman, P., Channels. 2010, May/June, 4:3, 241-247.
3. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L., Hegemann, P., Deisseroth, K., Nat Neurosci.
2009, Feb;12(2):229-234.
4. Catterall WA, Perez-Reyes E, Snutch TP, Striessnig J. Pharmacol Rev. 2005 Dec;57(4):411-25.
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