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如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来-9

广州市昊洋贸易有限公司

2023-12-15

影响 qPCR 实验结果稳定性的潜在因素很多，而我们可控制的两个因素包括生物学差异和 qPCR 实验过程中的技术性差异。为准确分析 RT-qPCR 结果，实验设计除了应包括恰当的对照，还应该设置重复样本。

组间差异是由组内差异和处理效应共同导致的。组内差异包括采样个体间的差异、实验操作误差等等，这些差异是我们在实验时要尽可能降低的。而组内误差主要由生物学误差和技术误差引起的。

◆ ◆ ◆ ◆

一、重复类型

差异源自不同生物体个体间和不同组织或细胞培养间与生俱来的差别。技术性差异是在实验过程中，由于抽样误差或样本量差异等因素引入的差异。生物学重复是为了消除样本取样、核酸提取和反转录、qPCR 实验操作等步骤中的误差，包括生物学重复和技术重复。

无论是绝对定量还是相对定量，一般认为至少需要六次重复测定才能获得合理的置信度。然而，由于受样品获取、时间或成本的限制，可能有必要对这一理想值进行一定程度的缩减。

生物学重复：

实验条件处理下，从不同批次（时间/植株/反应板等等）的材料中获得多个样本（一般推荐≥3），这些样本后续做在同一 qPCR 实验，实验结果用于均值、方差、显著性分析。设置生物学重复主要用于排除不同样本之间的差异性和偶然性问题，评估组内误差，降低背景差异，检测离群样本，增强结果的可靠性。

技术重复：

同一个材料在 qPCR 加样时要进行至少三次重复。主要用于排除加样、耗材和仪器的误差，通常以三次实验结果取均值用于后续数据分析。

二、应该在哪些步骤设置重复

对于典型的 qPCR 实验，可在以下列步骤设置重复：

取样阶段（不同但生物学水平等效的样本，如来自对照组和测试组中同组的多只动物）；

核酸提取阶段（使用同一样本制备多个核酸样本，可设置技术重复）；

RT 步骤（从一个 RNA 样品中产生多个 cDNA 样品，可设置技术重复）；

PCR 阶段（对同一cDNA样本进行重复检测，可设置技术重复）。

生物学复制与技术复制的设置示意图。流程越靠后，设置的重复越多，数据变异性减少，反之亦然。例如，要了解患者的真实变异性，必须分析重复的生物学样本（如来自一名患者的不同样本、来自同一患者不同组织的样本或来自不同患者的样本）。与 qPCR 本身相比，RNA 提取和反转录过程对最终测量结果的影响更大。这种增加的变异性更能代表实际的变异性，因此，如果将这种变异性包括在内，就能使结果更具可信度。

在哪个实验步骤设置重复取决于实验的目的。例如，当估算食品中的转基因成分时，提取核酸的重复就很重要。然而，对于临床研究来说，生物学重复可能更有参考价值。

三、实例解读

实例1：如何设置生物学和技术重复

如前所述，要控制技术性差异，每个样本和实验条件应该包括至少3个技术重复。各技术重复反应成分应该是相同的，这样任何测量差异就都来自于技术性差异。对于生物学差异，最好能设置至少3个生物学重复，即对同一个生物体组织重复取样，或对某一个总体中的多个生物个体取样（例如，同一个处理组中多只老鼠样本)。

如下图中所示为最简单的实验设计，包括实验组和对照组，每组含3个生物样本。对于每个生物样本的每个靶标基因和内参基因，均设置3个技术重复，共需要36个样本，加上2重复 NTC ，总共40个反应孔。

案例2 ：设置含对照和重复样本的实验

如下图所示，研究 Normal 和 Mutant 小鼠在不同处理时间下的基因表达差异，具体如下：

设置内部阳性对照（IPC）：如内参基因，IPC 需要提前选择并验证，同时设计检测 IPC 的 RT 和 qPCR assay，并在数据分析步骤确认基因表达水平的稳定性；

取样步骤：在每个时间点，Normal 和 Mutant 组各自设置生物学重复样本5个；

RT 步骤：对每个小鼠样本，制备2个 RT 和 RT(-) 对照；

PCR 步骤：每一个来自 RT 步骤的 cDNA 模板，设置3个技术重复；每个 qPCR assay 推荐设置3个 NTC。

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四、总结

任何生物学实验都应该设置生物学重复和技术重复。对未知样品进行充分的重复检测可提高 qPCR 数据的可信度，在检测低浓度核酸时，这往往是提供充分透明信息的关键。

未完待续

敬请关注“如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来”系列文章，教会您如何在 MIQE 的指导下开展 qPCR（RT-PCR）实验，获得可靠的实验结果。

参

考

资

料

[1] T Nolan, J Huggett, E Sanchez, Good practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC (2013)

[2] Taylor, Sean C., et al. "The ultimate qPCR experiment: producing publication quality, reproducible data the first time." Trends in biotechnology 37.7 (2019): 761-774.

* BIO-RAD是BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。

* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。

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