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广州市昊洋贸易有限公司

2023-11-24

导读：我们在《如何使用 qPCR 技术成功的开展基因表达分析实验-上》中提到正式开展实验前需要进行设计 qPCR

我们在《如何使用 qPCR 技术成功的开展基因表达分析实验-上》中提到正式开展实验前需要进行设计 qPCR assay，并对其进行质量控制，也即优化和验证。首先，小编将为大家介绍如何进行 qPCR assay 的设计，共分为4期，本期为第4期。

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六. 建立PCR反应体系并验证

毫无疑问，以上介绍的 PCR 反应条件会影响 assay 的最终性能，所以需要通过以实验为基础进行测试，根据测试结果选择最佳的 PCR 反应条件，这个过程其实确认 assay 需不需要进一步优化。比如以下的研究就对每一个靶标基因设计了多个引物对，并对每个引物对进行了最佳 Ta、最佳引物浓度、cDNA 模板的最佳浓度、 R² 以及扩增效率E进行了测试和优化，这样就明确了每个靶标基因需要采用哪种最佳的 assay 来进行后续的检测。

表3.利用湿实验测试、评估引物的性能

6.1不同的检测 assay 在使用不同的预混合母液时性能不同

SYBR I Green 检测的引物浓度（100-400 nM）往往低于探针检测的引物浓度（300-900 nM），但也有例外情况。不同引物对的引物浓度不同，其效果也会大相径庭。有时，效果会非常显著，超过几个量级，从50到 600nM 的引物组合会导致超过20个循环的 Cq 差异。不过，一般来说，只要引物浓度不低于 100nM，影响就不会那么明显。图20展示了这一点，图中使用了两种浓度的引物对和五种不同的预混合母液。

结果表明，引物退火和浓缩的最佳条件受预混合母液的影响，不同供应商使用不同浓度的 Mg2+，并在缓冲液中添加未公开的稳定剂。遗憾的是，不同引物和预混合母液的结果并不一致。母液 B-E 中的一个引物对的引物浓度越高，Cqs 越高，而母液 A 的 Cqs 则越低（图 20A）。然而母液 B-E 在第二组引物浓度较高时，Cqs 较低（图 20B）。因此，在从一种PCR母液切换到另一种母液时，可能需要重新评估退火条件。

图20. 引物浓度对混合母液的影响，

使用五种商用混合母液进行扩增

A. 使用引物 CA-F 和 CA-R 以 300nM 或 600nM 的最终浓度扩增真菌基因组 DNA，并用 SYBR Green 化学方法检测 PCR 扩增子。在大多数混合母液中，引物浓度增加一倍的影响较小，最大影响是 Cq 增加 1.3。

B. 使用最终浓度为 300nM 或 600nM 的引物 BAR-1F 和 BAR-1R 扩增细菌基因组 DNA，并用 SYBR Green 化学方法检测 PCR 扩增子。引物浓度增加一倍对所有混合母液都有增强作用，最大作用是使 Cq 下降 2.3。

qPCR 反应条件的测试以及后续的优化，以上仅举几个具体案例，还会涉及到其它内容，具体可关注下一期。

七.多重检测

基于探针的 qPCR 检测的主要优势是能够在单次反应中进行多重反应以检测多个靶标，从而提高通量并减少样品和试剂用量。要想取得成功，多重 PCR 反应必须能够产生足够的扩增产物来检测所有目标序列。从多重反应中获得的结果应经过验证，以确认如果单独进行这些反应也能获得相同的结果。当靶标丰度不同时，可能会出现 "多重 PCR 饱和 "现象，即丰度较高的基因扩增使 DNA 聚合酶饱和，从而抑制了丰度较低的基因的扩增。降低扩增靶标的引物浓度（"引物限制"）可以避免这种情况。可选择专门的多重预混母液可以为多重 qPCR 提供与单重 qPCR 探针检测相当的动态范围和灵敏度，而无需限制或改变引物浓度。

在多重 PCR 中，不同检测方法的引物之间可能会发生意想不到的相互作用。设计高度特异的引物和探针是成功进行多重 qPCR 的关键和挑战。每种引物和探针都应具有相似的热力学性质，以支持使用相同的 PCR 热循环 protocol 对所有扩增子进行高效的 PCR 扩增。建议使用计算机辅助引物设计程序，以最大限度的减少每个引物、引物对以及引物/探针组合中 3'-末端的内部二级结构和互补的可能性。每个目标序列的扩增子大小应保持一致，并限制在 65-100bp 左右。

对于多重 PCR，探针荧光基团的选择也需要进一步考虑，所使用的 qPCR 仪器必须能够检测到所选染料的发射光谱。这些assay同时进行扩增，但使用不同的荧光报告基团进行独立检测。因此，必须选择荧光光谱分辨率高的染料组合，同时还要与 qPCR 仪兼容。这些仪器的光学规格差异很大，通常有 2-6 个检测通道。必须考虑激发光源，特别是用于检测的激发/发射滤光片。大多数 qPCR 仪首先是为 FAM/SYBR 设计的，而长波长荧光团的检测灵敏度可能较低。许多需 qPCR 要进行染料校准，以准确区分重叠信号，具体参考 qPCR 仪制造商或寡核苷酸制造商推荐的染料组合。

图16.优化水解探针检测 PCR 引物浓度的

典型实验结果

不同制造商对实时检测系统的激发和发射滤光片的设置也不尽相同，因此可能需要根据所选染料对仪器进行校准。Bio-Rad qPCR 仪器的固定光学系统的非常稳定耐用，无需为检测各种染料进行校准。

在设计探针时还应使用适当的非荧光淬灭剂化合物，以尽量减少背景荧光。可使用在线工具优化荧光团/淬灭剂和染料组合，如 IDT PrimeTime™ 染料选择工具5。

还应考虑总荧光强度。例如，荧光信号强度高的荧光团（如 FAM）是检测低拷贝转录本的理想选择。而对于高拷贝转录本（如看家基因），则应考虑信号强度较低的荧光基团。

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八、结论

Assay 设计是所有核酸量化研究的核心。必须小心谨慎的进行设计，但也可以按照上文详述的流程进行适当简化。

可靠的 qPCR 需要好的引物。这通常意味着绝对特异性、无发夹结构或交叉二聚体以及温度耐受性。良好的检测设计必须考虑到扩增子结构，并确保引物靶标位点不含二级结构。

目前有许多意见和指南可供参考，但其中许多信息可能不够准确，或者可能适用于传统 PCR，但在用于 qPCR 时需要进行精细的调整。每种 "新 "检测方法都必须经过适当的验证，其中计算机辅助的理论验证可作为初步筛选，剔除不符合一般要求的 assay。基于实验的测试、优化和验证是所有 qPCR 实验中必不可少的一部分，但却经常被忽视。这既适用于新设计的检测方法，也适用于从其他任何地方获得的“新”检测方法。最后，在公布 qPCR 数据时，应报告优化和验证过程的结果。