如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来-6（2）

3.1概述

理想情况下，每个转录靶标 RNA 或 mRNA 分子都能转化为一个 cDNA 分子，或者至少所有靶标 RNA 都能以相同的效率转录。然而，RT 效率的变化，无论是由于 RNA 样品质量、引物设计、RT 酶的选择或其他因素，都会影响 cDNA pool 中是否能更好的代表原始 mRNA 的种类和丰度。

RT 效率的变化是影响总体结果质量的一个被严重低估的因素（Bustin 等人，2015年），其影响延伸到大量已发表的基因表达研究。这进一步表明，必须按照 MIQE 指南的要求，严格记录和报告关键实验参数，如样本、核酸提取和反转录细节，这样才能正确解释有效的 RT-qPCR 结果。

下面将具体介绍影响反转录效率的实验条件，以及相应的注意事项。

3.2 RNA 纯化和纯度

减少 gDNA 污染的一种方法是在 RNA 分离方法中加入 DNase 步骤。DNase 处理步骤可在任何方法中的最后步骤添加。

此外，应使用无反转录酶对照（无 RT）来确定 RNA 样品中是否存在 gDNA。来自无 RT 对照的扩增产物是由于 gDNA 的存在，表明实验样本中也存在一定数量的 gDNA。基因组 DNA 污染会导致 RT-PCR 分析出现假阳性。在 RNA 抽提过程中或分离后立即用 DNase 处理去除 gDNA 可改善 PCR 结果。

RNA 的纯度和数量通常通过吸光度测量来评估。260 纳米吸光度（A260）用于确定 RNA 数量，260 纳米和 280 纳米吸光度之比（A260/A280）用于衡量纯度。高纯度 RNA 的 A260/A280比值应大于 1.8。某些专用仪器可以简化基于吸光度的样品 RNA 浓度测定。

利用已有的、扩增一致的 RT-qPCR assay 中加入纯度未知的 RNA，可用于来检测是否存在潜在的抑制剂。

最后，对 RNA 进行定量有助于将添加到每个反应中的 RNA 上样量保持一致。

3.3 RNA 的完整性

使用琼脂糖凝胶电泳可评估 RNA 质量的其他指标包括：

某些仪器软件利用这些相对数量计算出 RNA 完整性的排序，该编号从1到10不等。RIN 值在8及以上表示 RNA 质量较高，适合大多数应用。较低的 RIN 值表示 RNA 已降解，根据实验情况可能适合或不适合分析。例如，RIN=7 或更低的 RNA 可能难以检测稀有信息。

创造并维护无核糖核酸酶（RNase-free）环境的实验环境可将 RNA 降解问题降至最低。另外有条件的话，建议使用 RNase 抑制剂。

3.4上样样本：总 RNA 或纯化 mRNA？

在设计 RT-qPCR 实验过程中，决定是否要使用总 RNA 或纯化的 mRNA 作为模板进行反转录十分重要。尽管 mRNA 可能能够提供略高的灵敏度，但总 RNA 仍经常使用，其原因是总 RNA 作为起始材料具有较 mRNA 更重要的优势。

总的来说，由于在大多数的应用中，靶标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更为重要，因此在大多数情况下，总 RNA 更适用。

因此RT 步骤推荐用总 RNA ，这样就能产生大量具有代表性的转录本（覆盖率高的 cDNA，通常通过两步法）。

3.5 RNA 的二级结构

如果要获取全长 cDNA，那么 RNA 二级结构的问题就无可避免，一般的反转录酶在遇到此类结构后，容易停止反应或从模板上脱落下来。要想判断模板 RNA 是否具有二级结构还比较困难，但如果基因中 GC 含量较高，这通常意味着 RNA 很难被变性且结构较为复杂，此时需要 65℃，5 min 对其进行充分变性，打开复杂结构以避免其对实验结果的影响。

3.6 RT 引物策略

RT 步骤中的一个变异来源是启动 cDNA 合成的引物策略的选择，引物可以是目标基因特异性的，也可以是非特异性的。一般来说，RT 步骤有三种不同的引物策略：

反转录后得到的 cDNA 产物种类和长度。

Oligo-dT

Poly-dT 寡核苷酸（由 16-25 个脱氧胸苷残基组成）可以退火到大多数 mRNA 上的多聚腺苷酸化 3'（poly-A）尾部，这有利于对样本中的整个 mRNA pool 进行特异性、选择性的反转录。这种方法虽然在概念上非常简单，但也存在一些问题：

尽管存在这些局限性，但由于 Oligo-dT 引物可以靶向 mRNA 的3'端，因此这种方法在研究整个 RNA 分子时非常有用。

随机引物

如随机六聚体、八聚体或十聚体引物混合物可用于规避 RT 期间生物样本间的较大检测差异。这些随机引物将在单链 RNA 的不同位置退火，并为反转录酶提供多个起始点，随机引物沿着转录本进行杂交，对二级结构的容忍度更高。因此，一个起始 mRNA 会产生不同长度的片段。整个 RNA 样品都会被有效的反转录，从而合成一个包含所有 RNA 片段的总 cDNA pool，所有不同长度的 cDNA 片段代表了原始 mRNA 的信息，包括高含量的核糖体 (rRNA) 亚基、SS、18S 和 28S 以及 tRNA 家族。

随机六聚体是随机序列的短寡核苷酸，对于长（>4kb）或缺乏 ploy（A）尾的转录本（如原核生物 mRNA）可能是首选。它们可以沿着转录本在多个点启动反转录，因此适用于长 mRNA 和具有重要二级结构的转录本。通常使用6个引物，但使用8或9个引物可能有助于合成较长的 cDNA，因为它们的杂交结合频率较低。

基因特异性引物

主要用于一步法RT-qPCR，因为寡聚（dT）或随机引物无法在 qPCR 步骤中对 cDNA 目标进行特异性扩增（该过程中没有单独的 RT 步骤）。转录整个 RNA 相比，特异性引物可靶向特定的序列，从而提高灵敏度。还可与高达 60°C 的较高 RT 反应温度配合使用，以消除二级 RNA 结构和假转录本。在这种情况下，只能合成一个与目标基因 mRNA 互补的 cDNA。

建议设计跨越内含子或内含子-外显子边界的引物，由于含内含子的基因组DNA序列不会被扩增，可以确保 cDNA 是由剪接的 mRNA 序列而不是 gDNA 中的母源基因序列合成的，因此这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性的几率。

小结：