如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来-11

荧光定量 PCR (qPCR) 已成为量化不同样本间基因表达水平差异的权威技术。在过去10年中，该方法迅速流行，查阅 RT-PCR (qPCR) 学术资料，出版文章超过250,000篇，涉及多个领域，包括农业、环境、工业和医学研究等等。

除了该技术的广泛适用性外，刺激这一显著增长的核心因素之一是期刊审稿专家要求使用 RT-qPCR 获得定量分子生物学数据以支持表型观测的现象，这种需求不断增加。此外，基因表达分析现在还被用来支持基于蛋白质组学检测的蛋白质表达数据。生物技术公司为配合这一技术的迅速发展，相继开发出各种可运行 RT-PCR 实验相关的试剂和仪器。然而，目前还没有建立严谨的规范，研究者们通常通过不同的信息来源来设计他们的实验，这使得实验数据的质量参差不齐。

许多技术缺陷可能会影响 RT-PCR 数据的质量，包括：不适当的实验设计，没有足够的对照和重复，缺乏对实验条件和样品处理技术的明确描述，低质量的 RNA 样品，反转录引物选择和 qPCR 反应不够理想，以及数据分析方法的不正确等。为帮助科学家们能产生一致的、高质量的 RT-PCR 实验数据，qPCR 实验数据发表所必需实验信息的最低限度标准 (MIQE) 已在2009年发表 (Bustin et al.2009)。

之后又开发了基于 XML 的荧光定量 PCR 数据标注语言建立起 RDML 协议，使荧光定量 PCR 数据得到统一 (Lefever et al.2009)。这一方案正积极发展恰当和标准化的术语、为生物和生物医药研究者提供的最小信息指南、灵活及广泛的数据文件架构，这些数据架构可通过各种工具来创建、处理和验证 RDML 文件。关于 RDML 项目的所有相关信息，请访问 www.rdml.org。

MIQE 和 RDML 的最终目标是建立一个清晰的框架，在此框架内进行 RT-qPCR 实验，并为审稿人和编辑提供指导方针，使其可以使用已构建的标准对投稿文章的实验过程、数据质量进行评价。同样，通过使用该方法所产生的数据对于研究结果更具有一致性、更具可比性、更可靠。

鉴于 mRNA 转录的高动态性以及样本处理和下游处理步骤中可能引入的变量 (Garson et al.2009)，RT-PCR 工作流程中每个步骤的标准化对于获得可靠、可重复的结果至关重要。MIQE 包含 85 个参数的检查表以确保高质量的结果，可满足任何期刊杂志的接收标准 (Bustin et al.2009)。

适当的实验设计是所有基因表达研究的关键。因为 mRNA 转录对外在因素敏感，因此必须在严格的对照及明确的设定条件下进行。花时间设计并确定实验过程、对照组、样品类型、重复类型和次数、实验条件和每组内的样品处理方法，这些十分必要，对于最大限度的减少变异性至关重要（表 1）。在进行基因表达实验之前，应仔细记录这些参数，以确保发表的数据具有良好的生物学可重复性。

无法立即处理，则在使用前需要一直把样品保存于合适的条件下 (冷冻于 -80℃ 和 /或保存于 RNA 保存液中)。为缩短 RNA 抽提过程中的操作时间，我们建议以10-20的小批次来进行样品处理。RNA 抽提过程应包括 DNase I 处理步骤以便去除基因组 DNA 污染。一些经济简便的试剂盒，比如 Aurum RNA 抽提试剂盒 (Bio-Rad Laboratories, Inc.) 可用于任何样品，包括植物和动物组织的处理， 该试剂盒中的过滤柱含 DNase I 。

使用部分降解的 RNA 会导致不一致和不正确的定量结果 (Fleige and Pfaff 2006, Gingrich et al. 2006)。由于样本纯度和完整性无内在关联性，因此两者都应进行评估，以确定 RNA 样本符合下游工作流程所需的最低接受标准。

样品 RNA 中是否有蛋白的污染可以通过 OD_260/280 分光光度法来进行检测。OD_260/280 比值在 1.8 到 2.0 之间则表示该 RNA 纯度好，没有蛋白和苯酚的污染（图 1B）。然而，分光光度法读数无法获得 RNA 完整性信息。RNA 的完整性可通过多种方法进行评估。传统的方法是在有荧光染料（如溴化乙锭）存在的甲醛琼脂糖凝胶上电泳后进行目测。如果观察到大亚基和小亚基核糖体 RNA（rRNA）有两条清晰的条带，大条带的强度约为小条带的两倍，这表明 RNA 是完整的。虽然这种方法成本低廉，但对数据的解读大多具有主观性，而且需要约 200ng 的总 RNA，如果样本数量有限，则采用该方法比较困难。使用光密度扫描成像仪量化 rRNA 条带的强度，能使这种方法更加完善。虽然不同组织或细胞类型的 28S/18S 比值可能不同，但比值在1和2之间则提示 RNA 样本的完整性。

基于微流控技术的电泳系统 (Imbeaud et al.2005)，如 Experion™自动电泳系统 (Bio-Rad) 的问世极大地改进了 RNA 的完整性分析。除了生成虚拟凝胶、电泳图和计算 28S/18S 比率外，Experion 系统的软件还能自动计算和报告 RNA 质量指标(RQI) 值(图 1C)，该指标根据电泳图的若干标准 (Denisov et al. 2008) 反映 RNA 样品的完整性。RQI 值从1(降解)到10(完好)不等，客观评估了 RNA 样品的完性，可用于筛选出降解的样本。

通过确保所有 RNA 样品的纯度和质量的一致性，可以减少生物学重复之间的差异( 图 1D)(Imbeaud et al. 2005)。当一批 RNA 样品符合质量控制标准后，我们建议立即将其用于 RT-PCR 实验，或通过反转录将其转化为更稳定的 cDNA，以便在质量控制后保持 RNA 的完整性。

鉴于 RNase 在环境中广泛存在，我们建议在质量控制检测后将总 RNA 样品立即反转录为 cDNA。这种处理避免了 RNA 样品在反转录为 cDNA 之前因反复冻融而导致的 RNA 降解。在反转录步骤中，关键是抽提的 RNA 样品能连贯完整的覆盖基组。有些基因很长，但这些序列对应的 RT 产物可能不是很长，尤其是 RT 引物只在每个 mRNA 的末端退火（碱基配对）的情况下。通过引物在 mRNA 末端退火以及在每个 mRNA 序列内的随机位点进行退火，可以很好的获得每个基因转录产物。这种方法比只在每个转录本的末端或随机位点退火更具代表性，能更好的覆盖整个转录基因组。

反转录缓冲液应包含：序列随机的引物(以便更好地随机扩增 mRNA 样品)；RNase H (一种能特异性降解 DNA/RNA 双链中 RNA 的酶)；特异且灵敏的反转录酶，动态范围广，适用于 1µg至 1pg 的 RNA 上样量；以及简单快速的实验操作。iScript™ cDNA 合成试剂盒 (Bio-Rad) 符合所有这些标准，非常适合反转录任何总 RNA 样品。我们建议为了减少不同生物学重复样品的差异，每次反转录反应使用的 RNA 的上样量和反应时间应相同。逆转录的 RNA 在使用前可冷冻保存在 -20°C 或 -80°C 下，并在下游 qPCR 反应使用前稀释。

引物和靶标序列的精心设计对于确保特异性和高效率的扩增产物至关重要。靶标序列应是唯一的，长度为 75-150 bp，GC 含量在 50-60% 之间，且不应包含二级结构。建议引物的 GC 含量为 50-60%，熔解温度（Tm）为 55-65°C。应避免引物中出现连续 G 或长 C，但建议在引物末端含有 G 或 C。

有许多程序可以帮助设计引物对和挑选靶标序列。我们建议使用 Primer-Blast 设计寡核苷酸，该程序由 NCBI 开发，使用 Primer3 算法（Rozen and Skaletsky，2000）。将引物序列与用户选择的数据库进行比较（BLAST），以确保引物序列对靶标基因具有唯一性和特异性。

MFOLD 程序可用来分析扩增子是否存在阻碍有效扩增的二级结构（Zuker, 2003）（图 2）。理想情况下，应订购两套寡核苷酸，并测试它们在 qPCR 反应中的实际性能。

退火温度、融解曲线分析、扩增子凝胶分析和无模板对照的确认

PCR 反应的一个关键步骤是引物与目标序列的退火（碱基配对）。必须在合适的温度下，引物才能有效的退火到目标序列上，同时防止非特异性退火和引物二聚体的形成。确定最佳退火温度的最快方法是使用配备温度梯度功能的热循环仪。所有 Bio-Rad 热循环仪和 qPCR 仪器都有温度梯度功能选项。应该测试引物理论 Tm 附近的一系列温度（图 3A）。

通过分析 PCR 产物来评估反应的特异性非常重要。在 PCR 循环结束时进行熔融曲线分析，可以确认引物退火的特异性。熔融曲线应显示一个尖锐的峰值（图 3B）。此外，每对引物至少有一个样本的扩增产物应在适当的凝胶（琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，以识别较短的 DNA 片段）上检测，以确认扩增子的大小符合预期（图 4）。另外，也可以使用全自动电泳系统来快速准确的确认扩增片段的大小。

因为大多数 qPCR 实验在一个扩增过程中会对多个基因进行研究，所以设计退火温度相近的不同引物，使得在同一次反应中使用的退火温度适合所有引物对就十分重要。每次运行中每个引物对都应包括 2 个无模板对照（NTC）反应，以检测缓冲液和溶液是否有 DNA 污染，并评估引物二聚体。

建立标准曲线以评估 PCR 扩增效率

PCR 反应的扩增效率是指聚合酶将各种试剂组分（dNTPs、寡核苷酸和模板 cDNA）转化为扩增子的合成速率。每个周期结束后扩增子的最大增幅为2倍，代表反应效率为 100%。测量扩增效率非常重要，因为它能说明 qPCR 反应中存在的问题，而这些问题可能会导致错误结果。反应效率低（<90%）可能是由于 Taq 抑制剂污染、退火温度过高或未达到最佳退火温度、Taq 酶过久或失去活性、引物设计不当或扩增子具有二级结构造成的。过高的扩增效率（>110%）通常是引物二聚体或非特异性扩增子造成的。导致扩增效率过高或过低的最常见原因是移液器校准量程不准确或移液操作有误。

标准曲线一般被用来确定 qPCR 的扩增效率。 标准曲线所用的模板一般是 cDNA 或质粒 cDNA。

我们建议实验从 cDNA 样品的最高浓度开始，可设置8个10倍系列稀释的点来确保标准曲线能覆盖实验中所有可能会用到的模板浓度（即形成宽的动态范围）。对每个稀释度来说，标准 qPCR 流程中每个引物对要重复三次来确定 Cq 值。将模板起始量的对数与获得的 Cq 值进行对比，即可绘制出标准曲线，其后所得的线性回归直线方程，以及 Pearson 相关系 (r) 或决定系数（R²）可用来评价 qPCR 反应是否需要优化。

理想情况下，梯度稀释系列将产生技术重复之间重叠、梯度稀释之间间距均匀的扩增曲线（图 5A）。如果每个扩增周期都出现完美的加倍（2倍），则荧光曲线的间距将由公式 2ⁿ=稀释因子确定，这里 n 是指各曲线在荧光阀值时的循环数值的差（ 即不同曲线之间 Cq 值的差值）。例如，将 DNA 稀释10倍，2ⁿ=10。因此，n=3.32，即表示不同曲线的 Cq 值之间相差为3.32个循环。均匀间距的扩增曲线（图 5A）将产生线性标准曲线（图 5B），其扩增效率应在 90-110%。

标准曲线的 r 或 r² 值表示实验数据与回归曲线的拟合程度，即数据的线性化程度。线性度反过来又可以衡量重复孔之间的偏差（变异），以及不同起始模板拷贝数的扩增效率是否相同。不同重复之间观察到的 Cq 值差异较大，会降低 r 或 r² 值。对于 RT-qPCR 反应，r 的绝对值≥0.990或 r² 值＞0.980。可能需要删除标准曲线两端的点，以获得可接受的斜率（扩增效率）和 r² 值。这将最终确定每对引物的 cDNA 浓度、样品稀释梯度相关的动态范围。

qPCR 试剂,仪器,以及数据分析工具

Bio-Rad 的 CFX Opus 系列以及 CFX Duet 荧光定量 PCR 检测系统完全符合以上所有的标准。

Bio-Rad 的 CFX Maestro 软件符合以上这些标准，并随 CFX Opus 系列以及 CFX Duet 荧光定量 PCR 检测系统一起提供。

在 RT-qPCR 实验中，内参基因被用来作为数据归一化的对照，以校正作为模板的 cDNA 所存在的数量差异( Gutierrez et al. 2008,Huggett et al. 2005, Vandesopmpele et al. 2002 )。因此，完美的参考基因应该是在不同实验条件或时间点的样本之间表达量不会发生变化的基因。尽管一些基因如 GADPH、ACTB 或 rRNA 常被用作参考基因，但一些研究表明，这些基因的表达在不同组织或不同处理方式之间可能会有很大差异，因此可能不适合用作参考基因。因此，必须通过实验得到的数据来仔细选择参考基因，我们建议采用以下方案：

良好的参考基因在同质和异质样本中的 M 值应分别低于0.5或 1(Vandesompele et al.2002)。geNorm 还能帮助选择最佳参考基因数量，通常，需要三到五个好的参考基因才能实现最精确的归一化 (Vandesompele et al. 2002年）。另外，因为任一特定的基因都可能受不同实验条件影响，我们建议在实验中同时检测的内参基因位于不同的代谢途径或代谢通路中 (Vandesompele et al. 2002)。

基因表达实验中有两个可能影响实验结果的变异性来源：

为减少生物学和技术差异的影响，一般认为每次实验至少要进行三个生物重复，每个生物学重复至少要进行两次技术重复（图 6）。如果实验是比较对照样本和处理样本之间的基因表达水平，则三个生物学重复样本应该来源于在独立实验中分别进行处理的样品。

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* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。