我们在《如何使用 qPCR 技术成功的开展基因表达分析实验-上》中提到正式开展实验前需要进行设计 qPCR Assay，并对其进行质量控制，也即优化和验证。接上篇，小编将为大家介绍如何进行 qPCR Assay 的优化和验证。
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四、标准曲线
验证 qPCR Assay 的常用方法包括构建标准曲线，从而确定 qPCR 检测的效率、线性动态范围和可重复性。
确定扩增效率的最佳方法是使用模板的系列梯度稀释生成标准曲线，并从 Cq(y 轴)与 log [数量] 的线性回归图中确定斜率。如果每个扩增周期都出现完美的加倍，那么荧光曲线的间距将由公式 2n=稀释因子决定，其中 n 是曲线之间的循环数。例如，cDNA 稀释10倍，2n=10。因此，n=3.32，每稀释10倍，Cq 值应增加约 3.32 个循环。关于扩增效率和斜率的解释和关系，请参考往期文章。
图1.完美的梯度稀释系列的扩增曲线
每个梯度之间均匀分布，Cq 值相差3.3，严格的技术重复表现为标准偏差＜0.25，这样的数据非常理想。
要对可接受的 PCR 扩增效率进行评估，每个样本至少需要3次重复，覆盖4个数量级（最好是5个数量级）的模板浓度。这是因为即使 Assay 的扩增效率是100%，稀释度的变化也可能会导致扩增效率的一系列变化，如图2中显示，在低浓度时技术重复之间出现较为明显的差异。
图2. 标准曲线
通过使用引物对 DNA 样品进行1:10稀释，生成了一条涵盖7个梯度稀释 qPCR 标准曲线。根据测得的斜率（m=-3.346）计算出 qPCR 效率（E=99.0%）。还通过评估 R2 值(0.998)评估了数据与标准曲线的匹配度。此外，还评估了 PCR 扩增的引物对动态范围，Cq 范围为15至35。
R2 值是反应值与预测反应值之间相关性的平方，衡量在解释数据变化方面的拟合程度。R2 可以取0到1之间的任何值，值越接近1，说明模型解释的变异比例越大。例如，R2 值为0.998意味着拟合解释了平均值数据中99.8%的总变异。R2 值大于0.980则表明 Cq 与目标拷贝数之间的相关性很好。换个说法，这个值告诉我们稀释系列的数据点与最佳拟合线的相关程度。如果该值过低，则表明我们的数据与起始量的对数不存在线性关系。
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小结
Assay 的扩增效率推荐在90-110%，标准曲线的 R2 应大于0.980（或 r>±0.990），技术重复样品的 Cq 值应相似。如上所述，用于标准曲线的模板浓度范围必须涵盖测试样本的整个模板浓度范围，以证明测试样本的结果在 qPCR assay的动态范围内。标准曲线还用于确定每个 qPCR assay的检测灵敏度、重现性、精密度、系统误差（方法误差）等。
图 3. 标准曲线的可重复性。在生成标准曲线时，严格技术重复表现为标准偏差＜0.25，这样的数据最为理想。
当 Cq>30 时，稀有靶标的 qPCR 扩增会出现随机效应。这导致相关标准偏差大于0.25的技术重复的重现性很差。无模板对照（NTC；橙色线）显示无扩增，表明无引物二聚体。
4.1 PCR 扩增效率
qPCR 反应的效率是指聚合酶将试剂转化为所需扩增片段的程度。影响 qPCR 反应效率的因素有很多，如扩增子长度和序列、引物序列、样品中的杂质和抑制剂以及循环条件等。如果使用 ΔΔCq 计算方法（Pfaffl，2001 年），确定 qPCR 扩增效率尤为重要。一旦生成标准曲线，qPCR 反应的效率就可以根据标准曲线对数线性部分的斜率计算出来（Bustin 等人，2009年），E%=[10(-1/斜率) -1]%。
图4.扩增曲线与标准曲线的对应关系
优化的 qPCR 扩增效率应在90-110%之间（Taylor 等，2010年）。qPCR 中使用的相关靶标基因和参考基因都应具有最佳的扩增效率。如果扩增效率异常，可能的原因有：
过低的扩增效率（<90％）可能存在的原因：
引物探针设计不好或扩增子具有二级结构
温控反应条件不合适
试剂、酶无活性或活性降低
移液、稀释、加样误差
标准曲线动态范围窄
样品抑制，抑制剂等
过高的扩增效率（>110％）可能存在的原因：
实验中存在或非特异性扩增、引物二聚体
标准曲线动态范围窄
基因组 DNA 污染
移液、稀释、加样误差
试剂的选择
如果引物设计不当，出现非特异性结合和脱靶扩增，扩增效率会增加（非真实靶标信号），比如在使用 SYBR Green 等非特异性荧光染料时会产生额外的荧光信号。此外，如前所述，引物二聚体的形成和杂质的存在也可能导致扩增效率的提高。相反，如果引物与目标 mRNA 的互补性达不到100%，则会使扩增效率低于可接受的水平。扩增子中存在多聚 A 尾等二级结构也会导致扩增效率下降（Johnson 等，2014年）。
4.2 标准曲线的线性动态范围
标准曲线的线性动态范围是 qPCR Assay 检测未知浓度样本的性能为线性的范围。应始终评估动态范围，其最小值为 3 log10，最好能扩大到5或 6log10 的大范围浓度。
可能需要删除标准曲线一端或两端的点，以获得可接受的扩增效率和 R2 值。这将确定一对引物在不同 DNA/cDNA 浓度下的动态范围。从 qPCR 实验中获得的任何 Cq 值都必须在此线性动态范围内。如果一对引物检测特定样品的 Cq 值低于标准曲线动态范围的最低 Cq 值，则应稀释该样品，使 Cq 值在既定标准曲线的动态范围内。
图5.梯度稀释实验示意图，注意要设置 NTC 对照
鉴于标准曲线的起点应该是浓度最高的样品，因此标准曲线动态范围的中间点应该作为每个 样品的理想稀释因子。例如，如果发现动态范围介于 Cq 值20到30之间，则应将 Cq 值25作为 DNA/cDNA 样品理想稀释的目标值。这相当于5(25-20)的 delta Cq 值，因此建议该稀释倍数为32(25)。因此，根据特定项目中不同引物对的动态范围，在进行基因表达评估的 qPCR 项目中可能会使用不同稀释度的相同 DNA 样品。
五、多重 qPCR Assay的验证
如果选择了合适的试剂和探针，还不能直接把它们混在一个试管里就开始扩增样本，还需要在单重和多重实验中对 Assay 进行测试，以确保它们有相同的性能。在同一个混合液中会发生多种不同的反应，需要确认一种 Assay 不会与另一种 Assay 发生竞争（比如竞争反应组分），或者不同的 Assay 不会因为引物二聚体的形成等原因而相互抑制。
要做到这些，只需将这些 Assay 通过之前讨论过的类似验证过程即可。比方说，有两种不同的 Assay 要进行多重检测，分别标记为 A 和 B。要确保 A 和 B 的探针标记了不同的荧光团，它们将通过 qPCR 仪器上的不同通道来读取。例如，Bio-Rad 的 CFX Real-Time PCR 系统有多个 LED 和光电二极管，可以读取不同的波长的信号。可以用荧光基团（如 FAM）标记 Assay A，用另一个荧光基团（如 HEX）标记 Assay B。
图6.两重反应的验证实验操作
图7.两重反应的验证示例
基因 A 的两条曲线（一条来自单孔，另一条来自混合孔）都是相同的。基因 B 也是如此。因此，两种 Assay 之间不存在负面抑制作用，则可以继续检测未知样本。但是，如果基因 A 或 B 的 Cq 值在单孔和复孔之间有显著差异，那么这可能表明这两种 Assay 不能很好地组合在一起，可能需要重新优化。
要从多重检测中获得准确的结果，必须确保任何靶标的扩增都不会影响另一个靶标的扩增。要确定多重检测中所有反应是否独立进行，可在同一个反应板中对靶标分别进行单重和多重检测，并比较 Cq 值。特定靶标在单重和多重检测中获得的 Cq 值应无明显差异。如果单重反应和多重反应的 Cq 值相差很大，则需要对反应进行优化。在优化的 PCR 条件下对每种混合物分别进行这些检测以及多重检测和 NTC 检测，然后检查每种检测的扩增曲线。
如果我们发现这些 Assay 之间没有抑制作用，那么就可以像优化单重 Assay 那样优化多重 Assay。我们将使用阳性对照模板运行标准曲线，最好是多个10倍稀释度，并检查以确保多重检测中的每种检测方法都能将扩增效率维持在90%到110%内，而且每组引物/探针的 r 平方值都在0.98或以上（最好尽可能接近1）。一旦检查并确认了这些要点，就意味着验证了多重 Assay，并可以使用多重检测来定量检测未知样本中的多个靶标。
图8.通过标准曲线验证不同检测通道中每个 Assay 的扩增效率
六、千万不要忘记设置对照
为了准确分析 qPCR 数据，每次实验都需要设置多个重复和对照。
技术重复： 对于要比较的每个实验样本和对照样本，建议至少进行三次技术重复，以尽量减少移液和反应设置造成的误差。
无 RT 对照： 使用 cDNA 模板（即两步 RT-qPCR）时，应对每个反转录反应进行 "无反转录酶 "对照，以识别来自污染 gDNA 的信号。
无模板对照： 在 qPCR 过程中，应为每次检测设置 "无模板对照"，以识别样品制备过程中可能出现的交叉污染。
内参基因：对于基因表达分析，应分析多个参考基因，以确保基因表达稳定。使用表达模式不受测试条件影响的内参基因非常重要。
对照可帮助我们了解 qPCR 实验可能出现的意想不到的结果，是 assay 验证的必要组成部分，设置对照和重复有如下好处：
无模板对照（NTC）： 模板污染、引物二聚体、探针降解
无逆转录酶对照（noRT）： 是否来自基因组 DNA 扩增
阴性样本： 非特异性扩增（非特异性引物/探针结合）
阳性对照： 验证检测性能，判断是否存在抑制作用
只有对照才能检验数据的好坏！
七、总结
qRT-PCR 是许多实验室常用的基因表达分析技术。然而，为了确保 qPCR 结果的准确性和可重复性，必须采取严格的程序。设计的引物应根据 MIQE 指南进行验证。从文献中获取的引物序列也应执行同样的验证步骤，因为许多已发表的引物序列尚未按照 MIQE 标准进行验证。制备系列稀释梯度，生成标准曲线是 Assay 验证最重要的方法，同时也是 MIQE 指南的重要内容，其目标是提高 qPCR 结果的可靠性，从而提高科学文献的完整性和实验室间结果的可重复性，并最终增加实验的透明度。
Assay 优化和验证可以同时开展，互为补充，验证时发现问题，就可通过优化来解决问题；优化后的 Assay 可以提高 Assay 的稳固性和可靠性，更容易通过广泛接受的验证标准。
未完待续
敬请关注“如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来”系列文章，教会您如何在 MIQE 的指导下开展 qPCR（RT-PCR）实验，获得可靠的实验结果。
下期预告：
《史上最全反转录 RT 攻略》系列，带您系统掌握 RT 的方方面面，敬请期待~
参
考
资
料
[1] https://www.bio-rad.com/en-cn/applications-technologies/qpcr-assay-design-optimization?ID=LUSO7RIVK
[2]MIQE qPCR & dPCR How to apply the MIQE guidelines - a visual, interactive and practical qPCR & dPCR guide 5th Edition (20th February 2022)
[3] T Nolan, J Huggett, E Sanchez, Good practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC (2013).
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* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。