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如何让你的SCI文章MIQE起来-1 - 符合 MIQE 指南的 RT-qPCR（qPCR）基因定量策略（上）

广州市昊洋贸易有限公司

2023-10-20

当准备进⾏ RT-qPCR（qPCR）实验时，⾸先需要确定实验该如何设计，思考本次实验的⽬的是什么，想得到什么样的结果，是做绝对定量还是相对定量合适？

今天⼩编带⼤家来了解绝对定量与相对定量的区别，将重点介绍基因定量策略类型的优缺点，从⽽深⼊了解其局限性以及 RT-qPCR 效率如何影响基因定量结果，从⽽选择最适合您实验的定量策略。

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⼀、定量策略：绝对定量 or 相对定量？

选择哪种 RT-qPCR 定量策略是基因定量实验流程的关键组成部分，也是 MIQE

指南所要求的。⼀般来说，定量 RT-PCR 的⽔平可采⽤两种策略，即表达基因的浓度可以通过绝对定量或相对定量来测量。

绝对定量利⽤标准(或校准)曲线将 PCR 产⽣荧光数据与起始拷⻉数相关联起来，因此，校准曲线⽤于确定未知分析物的浓度。尽管传统上称为 “绝对定量”，但最好将这种⽅法称为 “校准定量”。这是因为，在这种情况下，“绝对” ⼀词具有误导性，因为待测样品的浓度实际上是与校准曲线中使⽤的标准样品的浓度 “相对”测量的。此外，数据的可靠性还依赖于 RT-qPCR 中待测靶标和标准曲线的 “相同” 的扩增效率。另外还可以采⽤ ddPCR 技术进⾏绝对定量，可避免使⽤标准曲线。

相对定量不需要校准曲线，初看起来要⽐绝对定量更容易开展（实则不然）。相对定量⽤于测量 mRNA 表达相对于对照样品的变化量/率，它主要基于靶基因相对于⼀个或多个内源性表达参考基因（管家基因）的表达。对于⼤多数实验⽬的来说，相对定量⽅法已经⾜够，例如研究 mRNA 或 microRNA 基因在不同⽣理条件下的表达变化。⽤于表⽰相对量的单位通常为 “x 倍变化”，并且可以在多个实验中⽐较相对表达量。

图1 符合 MIQE 指南的 RT-qPCR 定量检测

⼆、绝对定量

定义

绝对定量常⽤于精确计算初始模板中⽬的基因的浓度，⽐如测定⾎液样品中病毒颗粒数（DNA 或 RNA），细胞中靶基因的拷⻉数等，得到的数据是对单个样本的定量描述，不依赖于其他样本。采⽤绝对定量法，需要⼀种稳定的 DNA/RNA 标准物质⽤于⽣成校准曲线，因此必须具有已知浓度。如果应⽤得当，校准曲线的重现性很⾼，可以⽣成特异性强、灵敏度⾼、重现性好的数据。

理想情况下，C_t 值与模板起始拷⻉数的对数存在线性关系，这种关系表现在图上就是标准曲线（下图2）。绝对定量的检测即根据标准曲线对未知样品进⾏的定量。

具体方法如下：

⽤已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量，将标准品稀释成不同浓度，作为模板进⾏ PCR 反应。以标准品拷⻉数的对数值为横坐标，以测得的 C_t值为纵坐标绘制标准曲线:C_t=-klg^X0+b。对未知样品进⾏定量时，根据未知样品的 C_t 值，即可在标准曲线中得到样品的拷⻉数。

图2 RNA 标准曲线

从上图可以发现，当模板起始浓度越⼤时，荧光达到阈值的循环数越少，即 Cq 值越⼩。反之，模板起始浓度越⼩时，Cq 值越⼤。

做绝对定量实验需要关注以下几点：

PART01

外部校准曲线模型必须经过全⾯验证

因为其准确性、灵敏度、重现性和定量范围完全取决于所⽤标准物质和曲线的准确性。然⽽，制备 RNA 标准品存在⼀些困难，在设计、合成、精确浓度的确定以及保持⻓时间储存稳定性都不是简单的事情。低浓度的 RNA 对降解⾮常敏感，因此需要储存在良好的缓冲液中、不含 RNAse 的环境中，并由研究⼈员负责处理。低浓度（如低于100个分⼦）RNA 标准物质的稳定性对⾼重现性尤为重要。

如图2所⽰，在模板拷⻉数较低（<10³）的情况下，检测的变异程度要⾼于拷⻉数较⾼的情况。在拷⻉数很低的情况下，即每管低于20个拷⻉时，采样误差（泊松误差定律）导致的随机变异会变得很⼤。但正是在这⼀变异敏感区间，靶标定量对分⼦诊断具有极⼤的意义，例如在低⾎浆浓度、感染后早期检测 RNA 病毒或细菌，或对有限样本材料中的稀有转录本进⾏定量。

校准曲线的动态范围可达7个数量级，从10¹到10⁸不等，这取决于所⽤ RNA 标准物质的稳定性。建议校准曲线应⾄少有五个连续稀释（如10倍），每个样本设置三个技术重复。稳定性和重现性取决于所⽤标准物质的类型、基质/组织提取物、RNAse 的存在以及操作⼈员按照 "良好实验室规范 "进⾏的⼀般处理。

PART02

如何选择制作标准曲线的标准品？

为了保持与实际检测样品间的扩增效率的⼀致性，作为标准品应尽量选择与实际检测样品结构近似的样品。以基因组 DNA为模板时就要选择基因组 DNA 作为标准品；进⾏mRNA表达解析时最好选择表达⽬的基因的 Total RNA (或以 Total RNA为模板合成的 cDNA) 作为标准品。即使扩增碱基序列相同，但整体模板不同，也有可能导致 PCR 扩增效率不同（⽐如基因组 DNA 和质粒 DNA 等）。

对于合适的 RNA 标准材料，可使⽤商业合成的 RNA，或体外转录的 RNA、重组RNA、通⽤标准/参考材料，或具有已知浓度的 mRNA 或 microRNA 转录本的转录组。

PART03

关注反转录（ RT ）变异性，

确保稳定的 RT 效率

基于 RNA 的校准曲线的⼀个重要问题是，它们会受到反转录（RT）变异性的影响，从⽽增加校准曲线的变异性，尤其是在低浓度时。为获得最佳、最具可重复性的结果，应同时对⽣物样本和校准曲线进⾏ RT 反应。研究表明，RT 反应⾼度依赖于所使⽤的 RT 酶（RT 效率从<3% 到超过70%），⽽且技术重复之间的变异性很⾼（⾼达30%）。⽬的是在所有⽣物样本中获得相同的 RT 效率，以及标准 RNA和靶标 RNA 校准曲线的 RT-PCR 扩增效率。这必须事先得到验和确认，以获得可靠的 RNA 定量结果。

PART04

关注影响 RT 效率的因素：

RNA ⼆级结构和 RNA 背景效应

在对 RNA 定量时，另⼀个重要问题是RNA ⼆级结构的影响。⻓ RNA（如 2kb左右的 mRNA 或初级 microRNA）的天然三叶草结构和缓冲液或 pH 值相关的⼆级结构折叠会影响 RNA 序列的可及性。由于⻓度、稳定基质或缓冲液物质的不同，⼈⼯制备的 RNA 标准材料与原⽣、分离的 RNA 样品相⽐，可能具有不同的折叠特性。此外，不同折叠的 RNA 会影响内切和外切 RNAse 的可及性，从⽽影响降解的阻⼒，并影响引物的结合以及由于酶的合成性能⽽导致的 RT 效率。

与从⽣物样本中分离出来的天然 RNA 不同，⼈⼯ RNA 标准物质⾼度均⼀，⻓度和序列 motifs ⼀致。天然⽣物样本中含有⾼⽐例的亚组分，如核糖体 RNA(rRNA85-90%)、转移 RNA(tRNA~5-10%)、信使 RNA(mRNA~1-5%）和各种⾮编码 RNA 家族，如 microRNA、piRNA、siRNA、snRNA、snoRNA 和⻓⾮编码 RNA(~1-5%)。不同的 RNA亚组分会影响 cDNA 合成率，进⽽影响校准曲线的有效性，但影响⽅式尚不清楚。为了弥补这种复杂的 RNA 背景效应，在研究⼈体样本时，可以⽤从不同⽣物体（如植物、细菌或昆⾍细胞系）分离的 RNA 来模拟天然 RNA 分布。另外，也可以使⽤商品化的 RNA spike-in 来源作为 RNA 背景，如 poly-A RNA 或 tRNA。早期发表的研究结果表明，⼀般需要最低限度的 RNA 背景，⽽且它能提⾼ RT 合成效率。校准曲线中使⽤的低浓度标准 RNA 应始终⽤背景或载体 RNA 缓冲；否则，低浓度很容易被 RNA 酶分解或粘附在反应容器上。极⾼的背景浓度会对 RT 合成率和后期的 qPCR 效率产⽣更显著的抑制作⽤。

PART05

报告绝对定量的结果

⽆论所⽤标准物质的浓度确定的多么精确，最终的定量结果总是以常⻅单位为基础进⾏报告，例如每 ng 转录组（总 RNA）的中的 RNA 拷⻉数、每个分离细胞的拷⻉数、每克起始基质或组织的拷⻉数、每毫升⾎液的拷⻉数等。如果拷⻉数的绝对变化很重要（拷⻉数变异），那么分⺟（作为对⽐的标准物质）仍必须证明在⽐较的⽣物样本中绝对稳定。只有在免疫学和微⽣物学中测量⼈体组织中的病毒载量，或在⻝品卫⽣学中测量可⻝⽤基质中的病毒或微⽣物数量时，才可能需要这种准确性。分⺟的任何变化都会掩盖真实的变化，产⽣⼈为的变化和不正确的绝对定量结果。为了证明你选择的分⺟是合适的，谨慎使⽤标准材料和对照是⾄关重要

的。

此外，RT-PCR 技术对 PCR 反应设置中微⼩变化⼗分敏感，这始终是这⼀简便技术的潜在缺陷。因此，使⽤外部 RNA 标准品进⾏"绝对定量 "需要对其精确性（在同⼀ PCR运⾏中设置技术重复，报告为批内变异）和可重复性（在不同 PCR 运⾏中设置技术重复，报告为批检变异）进⾏仔细、耗时的优化，以发现特定应⽤中的局限性并满⾜ MIQE 准则。