●你的磷酸化 Western 结果是这样的:
●“别⼈”在《Nature》上的磷酸化 Western 结果是这样的：
图源：doi: 10.1038/s41586-021-03445-y
俗话说 WB 的套路深，⽽其中套路最深的就是磷酸化蛋⽩的 western 实验了，需要注意的事项太多：磷酸酶抑制剂、孵育条件、抗体选择、封闭液种类……哪个环节没有注意到，⼀两天的实验就⽩做了！蛋⽩质磷酸化在细胞信号传导过程中担负着重要的作⽤，我们在很多细胞⽣⻓、增殖、泛素介导的蛋⽩降解等过程我们都不可避免要涉及磷酸化蛋⽩的研究。
⽽最让⼈担⼼影响实验结果的就是stripping/Reprobing 环节了。要闭着眼睛剥离抗体，谁也不确定磷酸化⼀抗有没有剥离⼲净；也不知道会不会把⽬标蛋⽩也⼀起洗掉了。那么这种情况下，多⾊荧光就是磷酸化WB实验很好⼀个选择了。通常会使⽤⼀种荧光标记的抗体杂交磷酸化蛋⽩；同时，使⽤另外⼀种荧光标记的抗体杂交总蛋⽩（磷酸化和⾮磷酸化），然后通过不同荧光信号通道对磷酸化及总蛋⽩进⾏区分。这样就可以避免抗体剥离/重杂交的步骤，也避免了对实验结果的影响。
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在⼀篇研究论⽂ “CRL4AMBRA1 is amaster regulator of D-type cyclins”（Nature，2021）中，研究者使⽤了⼀种⾮常“⾼级”的多⾊荧光磷酸化 WB 实验⽅法 ，同时做出了磷酸化、⾮磷酸化蛋⽩条带，⼜做出了管家蛋⽩tubulin的条带，⽽且只使⽤了两种荧光染料。
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