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如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来3(中)

如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来3(中) 广州市昊洋贸易有限公司
2023-11-03
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二、如何选择适合自己实验的内参基因


没有一种内参基因在任何物种、任何器官、任何生理状态下都是恒定的,所以需要根据自己的实验目的和样本类型去筛选最适合的内参基因。具体可以参照下面的方法:

参考基因选择流程


第一步


从内参基因数据库、文献中查找与自己课题研究相关的特定物种、组织或细胞系,预选一组潜在的候选内参基因,建议最少10个,这些基因尽可能位于不同的生物学代谢通路,具有不同的表达水平。如果没有找到对应的物种或样本,可以通过相似物种、转录组数据中稳定表达的基因等。需要注意的是,在某些条件下,只使用普通的内参基因可能就足够了。

在这里小编强烈推荐

 ICG 数据库!!!

ICG 是 internal control genes 的缩写,即内参基因,更令小编兴奋的是这是由中国团队开发,不用翻墙即可获取。北京基因组所生命与健康大数据中心开发了国际上首个实时荧光定量 PCR 内参基因知识库——ICG,对经生物学实验手段鉴定出的内参基因及其应用场景实现了有效的挖掘、整合及注释;涵盖了540个物种,2618个基因,而且数据库还在不断更新。

ICG 知识库中动物的物种信息

每个物种信息中包含了基本描述、内参适用的样本类型、内参基因的信息(名称、应用、 genbank 的 accession 号、引物序列,Tm 温度和 qPCR 类型等信息)、内参基因的类型、评估方法等。该网站可以“一站式”解决内参基因的烦恼,从此“一站在手,内参无忧”。

通过以上方法就可以得到一组候选内参基因 pool,在预设的实验条件下,应使用选定的算法和评估标准对进行评估,以确定合适的参考基因,比如可以规定扩增效率至少>80%,这些数据有时可以从参考基因的来源处获得[3]



第二步


在预定的实验条件下对所有样本进行 RT-qPCR 实验,并通过归一化算法分析获得的 Cq 值。对于备选内参基因 pool,建议每个均选择 ~10 个代表性样本。

对于后续的相关实验(密切相关的实验条件、重复实验、或者新设计实验)来评估之前实验中用于归一化的基因,可能就足够了。也可以采用不同的算法以避免偏差,因为某些底层的计算算法可能会影响内参基因稳定性的最终排序顺序。

geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 以及 CFX Maestro 软件是目前最常用的用于评估内参基因稳定性的软件,具体如下:

geNorm

 NormFinder

BestKeeper

CFX Maestro




第三步


当这些候选内参基因达不到内参基因的标准时,就需要纳入更多的基因。如果实验条件偏差较大,则可能需要重新评估原始的起始内参基因 pool,以确定最佳的归一化基因,甚至可能需要纳入更多的候选参考基因。接着在按照上述流程,完成入组和验证。





总之,没有一种内参基因是万能的,针对不同的试验、不同的样本多试几种内参基因,找到适合自己的才是最好的。




未完待续


敬请关注“如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来”系列文章,教会您如何在 MIQE 的指导下开展 qPCR(RT-PCR)实验,获得可靠的实验结果。


 下期预告:

《如何为 RT-PCR 实验选择合适的内参基因(下)》,我们将比较上述4个计算内参基因稳定性的工具,敬请期待~




1、MIQE qPCR & dPCR How to apply the MIQE Guidelines,5th Edition

2、原博士带你做检验《一次性解决你的内参基因选择障碍》

3、Tony Remans, Els Keunen, Geert Jan Bex, Karen Smeets, Jaco Vangronsveld, Ann Cuypers, Reliable Gene Expression Analysis by Reverse Transcription-Quantitative PCR: Reporting and Minimizing the Uncertainty in Data Accuracy  , The Plant Cell, Volume 26, Issue 10, October 2014, Pages 3829–3837, https://doi.org/10.1105/tpc.114.130641

* BIO-RAD是BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。

* 本产品仅用于科研用途,不用于临床诊断。

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