如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来-1（下）

内参基因又称为“管家基因—housekeeping gene”，是指表达水平稳定不受实验条件影响的一类基因。内参基因相当于一个标尺，具有校正作用，避免待测样本回收率或者加样误差等因素带来的差异；具有标准化作用，内参基因表达相对稳定，以其为参照，反应基因表达水平的变化。因为引入内参基因进行了归一化处理，可以大限度地减少样本制备，处理时产生地各种差异，规避对样本精确定量和上样的要求。

例如，我们要研究几个不同样本中某个RNA，但它的表达量可能会因为所处的环境和其他因素干扰而出现差异，因此从样本中提取出来的 RNA 总量也不相同。但由于内参基因 RNA 的表达是相对稳定的，甚至是无论在何时何地都会处于一个稳定的状态。所以在做 PCR 扩增时，就要对内参基因同时做 PCR 扩增。

关于如何筛选理想的内参基因，我们将在后续的系列推文中进行介绍。

以上就是日常实验中常用的比较 Cq 值法，也即 2^-△△Cq 法，此公式用于计算所有待测样本与对照样本之间目的基因表达量的倍数变化，若 F 值 =A(A＞1)，则代表待测样本相对于对照样本表达量上调 A 倍；反之若 F 值 =B(1＞B＞0)，则代表待测样本相对于对照样本表达量下调 1/B 倍。

值得注意的是，2^-△△Cq 法需保证目的基因和内参基因的扩增效率基本一致才可使用。同时扩增目的基因和内参基因，通过查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确定扩增效率是否相似；或制作标准曲线计算每一对引物的扩增效率来评估扩增效率是否为100%。

PCR 扩增效率取决于许多因素，既存在抑制剂也存在增强剂，如下图所示，很显然不是每次都能达到理想状态，即 PCR 扩增效率为100%。在所有比较样品中稳定和恒定的扩增效率是样品之间实现可靠比较的一个重要标准。

在计算归一化的相对基因表达量之前，必须对所有研究的转录本、所有目的基因和参考基因进行可靠的 PCR 扩增效率评估。

一种有效的用来确定 qPCR 实验是否是最优化的方法：将模板稀释成一系列浓度梯度进行 PCR 反应，用这个结果作标准曲线，模板可以用已知浓度的样品(如纳克级的基因组 DNA 或多个拷贝的质粒 DNA) 或未知浓度的样品(如 cDNA )，如图 4A 和 4B。用模板初始量(或未知量样品的稀释倍数 )的 log 值对每个稀释样品的 Cq 值作图，两者呈递减的线性关系，称之为标准曲线。至少需要做3次平行重复，并至少做5个数量级倍数 (5logs) 连续梯度稀释模板浓度，绘制标准曲线，得到线性方程 Cq= -klgX0+b。

理论上，一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距，如果产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距由等式 2ⁿ=稀释倍数决定，这里 n 是阈值线上扩增曲线之间的循环数 (Cq值) 的差异。例如，10倍稀释的 DNA 样品，2ⁿ=10，因此，n =3.32，即 k=3.32，制作完标准曲线后，需要对其进行评估，评估指标有两个：相关系数 R² 和扩增效率（E）。相关系数 R² 反应了数据的线性关系，主要用来评估重复样品的可重复性和不同浓度的初始模板是否具有相同的扩增效率。R² 值应大于0.98，该值越接近1，表示线性关系越好，数据越准确，如图 4A。

扩增效率 (E) 计算公式：E=10^{-1/ 斜率}-1。一般认为扩增效率应介于90~110%之间，与之相对应的斜率介于-3.58~-3.1之间，如图 4B。

这种方法只将指数扩增阶段的选定数据纳入 PCR 扩增效率测定。在 PCR 反应的指数阶段，反应动力学仍处于 "全速扩增功率 "状态，没有限制。围绕这一阶段表现出真正的指数级扩增来计算"二阶导数的最大值"，对每个反应动力学进行计算，即可确定最大扩增效率。根据多项式曲线拟合 Yn=Y0(E)n，Yn 为第 n 周期获得的荧光，Y0 为初始荧光或基底荧光。在最佳条件下计算出的 PCR 反应效率范围在 E=1.75 到 E=1.90 之间，因此和上述的方式得出的结果类似，也不能和"梯度稀释 "得出的效率值直接比较。

因此，目前来看，"梯度稀释"是最常用的 PCR 扩增效率测定方法，符合 MIQE 指南的建议。后面介绍的两种单次运行来确定E值的方法都需要对数据收集和曲线拟合有更深入的研究，否则软件无法自动计算。具体哪种效率计算方法 "正确 "并能得出 "真正的 PCR 效率 "结果，还需要在进一步的方法学实验中进行评估。

如果按照 MIQE 指南进行相对定量，引入 PCR 扩增效率E进行校正，并使用多个经过验证的参考基因，生成的数据更接近采样时被测基因的真实生物状态。

《如何使用RT-PCR成功进行基因表达分析》，敬请期待~