反转录是基因表达研究、测序、克隆和其他应用的一个关键步骤。对研究人员来说，优化这一步骤是一个优先解决的事项，以确保下游的最佳结果。
一、反转录简介
由于RNA比DNA更脆弱，它不适合作为PCR扩增的模板。在基因表达过程中，一旦RNA被逆转录成cDNA，cDNA就成为qPCR扩增过程的实际模板。因此，必须先将RNA转化为互补的DNA（cDNA）。逆转录酶可以催化以RNA为模板的cDNA合成过程。
图1. 从mRNA模板生成cDNA的步骤。使用oligo(dT)引物，mRNA被逆转录成cDNA。之后RNA链会被水解。
有两种方法可用于RT-qPCR的基因表达定量："一步法 "或 "两步法 "RT-qPCR。两者都可以将RNA逆转录成cDNA，然后将cDNA作为模板进行定量PCR扩增。一步法或两步法是指逆转录和随后的实时PCR扩增是在同一或不同的PCR反应管中进行。
在一步法RT-qPCR中，cDNA的合成和qPCR步骤发生在同一反应中。两步法RT-qPCR将cDNA合成和qPCR扩增分开，因此它们发生在不同的反应管中。
二、一步法RT-qPCR
在一步法RT-qPCR中，cDNA合成和qPCR在同一个反应管中进行，使用基因特异性引物，在相同的缓冲液中进行。基因特异性引物指导cDNA的合成和特定目标序列的扩增，而且与随机引物相比，它们通常在更高的温度下退火。因此一步法方案通常比两步法工作流程使用更高的RT反应温度，并可采用能耐受更高反应温度的工程或新型逆转录酶。
一步法反应的主要优点包括最小的样品处理，减少工作台时间，以及封闭的反应管，减少移液错误和交叉污染的可能性。因此，一步法仍然是重复定量相同基因的理想选择，这在高通量应用和诊断环境中特别有价值。
RNA样品的质量和总量是使用一步法RT-qPCR的重要考虑因素。如果RNA的质量不高，而且样品之间存在不一致的抑制剂，反应效率会受到不同程度的影响，降低样品之间的可比性。此外，由于在一步RT-qPCR之后不能保存原始的cDNA合成产物，因此需要平分剩余的原始RNA样品等重复反应或评估其他基因的表达。
图2.Reliance One-Step Multiplex Supermix ,即用型、室温稳定的 4x 反应预混液，经过优化，可在单个反应中高灵敏的检测多达5个靶标。
三、两步法RT-qPCR
在两步RT-qPCR中，可以使用随机六聚体、oligo-dT引物和/或基因特异性引物来进行cDNA的合成。使用随机六聚体和/或oligo-dT引物的反应产生的cDNA是样品中各种RNA的混合物。cDNA合成反应可以适应更高的RNA input，提取和沉淀步骤可以用来浓缩和/或进一步纯化cDNA。尽管两步法的工作流程需要更多的时间，但它可以更好地控制用于qPCR定量的cDNA模板的数量。因为只有一部分cDNA产物用于随后的qPCR步骤，剩余的cDNA可以储存起来供将来使用，或者从一个RNA/DNA样品中定量检测多个基因的表达。
两步RT-qPCR将cDNA合成和随后的qPCR扩增分开，允许在选择RT酶时有更多的选择。这种灵活性对于控制序列代表性、效率和优化困难的RT-qPCR反应非常有用。
两步RT-qPCR的主要缺点是额外的开管步骤，更多的移液操作，以及更长的操作时间。其结果是出现变异和污染风险的可能性更大，因此，两步RT-qPCR不太适合于高通量应用。
四、一步法和两步法的区别
一步法RT-qPCR可以通过使用嗜热菌（Thermus thermophilus，Tth）聚合酶（一种具有固有RT活性的DNA聚合酶）或通过双酶系统结合反转录酶和热稳定DNA聚合酶来实现。由于Tth DNA聚合酶来自嗜热细菌，因此可以在较高的温度（>60ºC）下进行RT步骤，这可以使高GC含量的mRNA的二级结构最小化。
基因表达的准确分析依赖于反转录反的可重复性。逆转录的稳健性由所用逆转录酶的灵敏度、动态范围和特异性决定。来自莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）和禽髓母细胞瘤病毒（AMV）的反转录酶是最常用的酶。当需要长的或全长的cDNA转录物时，MMLV逆转录酶及其衍生物比AMV逆转录酶是更好的选择，因为其RNase H活性较低。据观察使用RNase H-逆转录酶进行的RT反应有时需要随后进行RNase H处理，以有效扩增某些模板和低浓度模板。
如上所述，两步RT-qPCR中的逆转录步骤可以使用oligo（dT）引物、随机引物、这两者的混合引物或基因特异性引物进行。引物的选择可能会影响您的目标基因的定量。基因特异性引物比oligo(dT)或随机引物的背景物质要少。如果您选择oligo(dT)引物进行反转录，您可能需要把PCR引物放在靠近转录本的3'端，以避免因截断mRNA而失去敏感性，这对较长的转录本尤其重要。如果您处理的转录本或物种有短的poly(A)尾巴或完全没有poly(A)尾巴，应避免使用oligo(dT)引物。对于5'-核酸酶试验，我们发现oligo(dT)引物的cDNA表现非常好；随机引物的cDNA在大多数序列中表现同样好或稍好，对某些序列则好得多。对于大多数PCR应用，使用iScript和iScript Select cDNA合成试剂盒的性能最佳，因为采用了MMLV RT。
图3. iScript Select cDNA Synthesis Kit，高保真、灵敏的逆转录试剂盒，具有极高的灵活性。该试剂盒的反应组分单独包装，针对特定需求可实现个性化的引物配置组合。
未完待续，下期再见~
参考资料：
1、Reverse Transcription (RT) (bio-rad.com)
2、Bulletin_6090 Amplification and Reagents and Plastics Brochure
* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。