提高WB转印效率的6大实验技巧

将靶蛋白高效的从凝胶中转移到印迹膜上是 Western 实验成败的关键步骤之一，需要根据样品及靶蛋白的性质做一定程度的实验优化。优化步骤取决于靶蛋白的大小、凝胶的化学性质等因素。以下是我们为您总结的提高 WB 转印效率的6大技巧：

3.1调整 SDS 和醇含量 

可以通过调整甲醇和 SDS 的浓度以提高蛋白转印效率。醇会增强蛋白与NC膜的结合，但会减小凝胶孔径；从转印液中去除醇会大大减弱蛋白与NC膜的结合。在转印缓冲液中添加 SDS（最多 0.1%）可提高蛋白质的转移效率，但会减少与膜的结合。因此，如果将 SDS 添加到转印缓冲液中，还必须添加甲醇（10–20%）。

SDS 还会增加缓冲液的电导率，从而增加转印过程中产生的热量。如果在转印缓冲液中添加醇，可能导致大蛋白（>100 kD）转印效果不佳。使用较小孔径的NC膜（0.2 µm） 可有效消除这种损失。

3.2对于大蛋白或高 pI 蛋白，您可以尝试以下缓冲液选项：

• Bjerrum & Schafer-Nielsen 缓冲液。使用NC膜（含甲醇）或 Zeta-Probe 膜（不含甲醇）：48 mM Tris、39 mM 甘氨酸（20% 甲醇），pH 9.2。将 5.82 g Tris 和 2.93 g 甘氨酸 [0.375 g SDS 或 3.75 mL 10% SDS] 溶解在去离子水中。加入200 mL甲醇；用去离子水将体积调节至 1 L。

注意：该缓冲液仅适用于湿转和 Trans-Blot SD 半干转。请勿将其与 Trans-Blot Turbo一起使用。

5.1湿转 

一般来说，建议使用 100V、60 分钟转印。如使用TGX凝胶，则100V 转 30 分钟。如需估计是否存在过度转印，可将两张膜叠在一起：如果第二张膜上有一些蛋白条带，请减少转印时间。使用过夜转印也可以获得更好的结果。

5.2半干转

使用 10–15 V 电压 15–30 分钟。跑胶完成后，立即将凝胶放在转印架上并开始转印；转印前请勿将凝胶用水冲洗或浸泡在水/缓冲液中。

与 Tris/Glycine凝胶相同的方案也可用于 Tris/Tricine 凝胶，但可能须缩短时间以防止小蛋白转穿。0.2 µm PVDF 膜是减少这种可能性的理想选择。由于小肽易扩散，因此平衡时间应限制在 10 分钟以内。

通常3-7分钟，即可完成转印。对于特殊靶蛋白，可能需要进行优化。对于其他条件，请使用制造商的说明。关于Trans-Blot Turbo的使用及优势，可观看以下视频：

• 当您从Tris-HCl 或 Bis-Tris 凝胶转换到TGX 凝胶时：TGX 凝胶可实现快速转印。所以，保持原有条件可能会增加蛋白转印效率，甚至出现转过的情况。为了避免转过发生，您可以减少转印时间。一般来说，对于 250 kD 的蛋白，您只需要传统凝胶所需时间的 50%。

• 当您从TGX 凝胶转换至 Tris-HCl 或 Bis-Tris凝胶时：将转印时间加倍（即 30 分钟至 1 小时）。

• 当您从半干转转换至过夜湿转时：Trans-Blot SD 半干转通常是 10 V 30 分钟或 15 V 15 分钟；而过夜湿转，建议使用 30 V 16 小时的条件。

• 当您从湿转转换至Turbo快转时：转印前无需平衡凝胶。如使用 PVDF 膜，请一定避免膜变干。根据靶蛋白分子量，使用适当的方案，然后调整条件。