为了应对 COVID-19 疫情，美国疾病预防控制中心（CDC）在2020年9月发布国家污水监测系统（NWSS）计划，旨在建设全国范围内追踪监测污水中 SARS-CoV-2 水平的能力，并针对污水监测的各个环节发布了操作指南，周期性更新。NWSS 启动近3年来来，取得了长足进步，我们对 NWSS 的具体内容做了调研，详见文章《WBE 实例：美国国家污水监测系统》。这些指南也经历了相对长时间的考验，证明目前阶段是可行的。接下来我们会针对各个操作指南最新版进行介绍，学彼所长。
需要注意的是，污水监测数据旨在补充其他 COVID-19 监测指标，为公共卫生行动提供信息。任何干预措施或公共卫生行动都不应仅仅基于污水的检测数据。
一、采样
二、样本处理
污水中 SARS-CoV-2 RNA 的样品处理包括样品制备、样品浓缩和RNA提取。因为污水是一种化学和生物上复杂多变的混合物，因此每一步所选择的方法必须适合污水样品。同时需要使用适当的实验室质量控制方法来评估这些处理程序的性能。处理可能含有 SARS-CoV-2 的污水样本应遵循适当的生物安全规程。
样品制备
正确储存和制备污水样品有助于确保 SARS-CoV-2 RNA 污水检测的准确性。
储存
收集后立即将样品冷藏在4°C，并尽量在24小时内进行处理，以减少SARS-CoV-2 RNA降解并增加监测效用。如果不能在采集后24小时内处理样品，应在-70°C冷冻前将基质回收质控品加入样品中。
均质化
液体污水和初级污泥样品在浓缩和进行下游处理之前应充分混合。将样品反复颠倒几次(液体样品)或通过机械混合来混匀。均质化样品还包括分解污水中固形物和病毒颗粒，可以使用超声进行均质化。
样本澄清
如果样品用于浓缩，去除较大固形体来澄清液体污水样品可以帮助后续的基于过滤的浓缩步骤。然而，去除固形物也会去除附着在这些固体上的SARS-CoV-2 RNA颗粒。您可以使用大孔径过滤器(5µm或更大)或离心来澄清样品。
样品浓缩
浓缩污水样品可提高对SARS-CoV-2 RNA的检测。浓缩对于未经处理的污水样品可能比初级污泥样品更重要。
迄今为止经过评估的可充分回收污水中SARS-CoV-2检测的浓缩方法包括:
超滤
通过负电荷属性的膜过滤，样品前处理加入MgCl2或酸化
聚乙二醇(PEG)沉淀
脱脂乳絮凝
超速离心法
在选择病毒浓缩方法时，请考虑以下因素:
样品类型:对于未经处理的污水样品，可以使用上面列出的几种过滤和沉淀方法。对于初级污泥样品，离心是浓缩固体最有效的方法。
样品体积:大量未经处理的污水样品体积可能需要在膜过滤(由于过滤速度慢)或聚乙二醇沉淀(由于离心机体积限制)之前对样品进行分离。大于5L的样品体积可能需要通过浓缩大体积的方法进行预浓缩，例如大滤筒超滤。
潜在的供应链问题:需要商业过滤产品的方法，如膜过滤器或超滤盒，可能比其他方法对供应链问题更敏感。
样品处理时间:浓缩方法的选择将受到样品处理时间和实验室人员可用性的限制。浑浊污水样品的膜过滤可能需要几个小时。
实验室设备的可用性:离心机的体积和容量，以及膜过滤装置的可用性，也将限制方法的选择。
RNA抽提
核酸提取纯化是从污水混合物中分离SARS-CoV-2 RNA的重要步骤。污水是一种复杂的混合物，含有已知会干扰病毒分子定量方法的物质，因此在选择提取方法时应考虑以下因素:
选择一种提取方案，旨在从环境样品中产生高纯度的核酸提取物。商业试剂盒可用于环境样品提取。
使用提取试剂盒或专门设计用于纯化RNA的方案，并在裂解前包含RNase变性剂。
通过将提取物放入单独的管中并在-70°C或更低的温度下储存，避免因多次冻融而导致提取的RNA降解。
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