如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来-5（中）

遗憾的是，研究人员通常不会验证他们从经过同行评议的 SCI 文章、其他实验室成员或供应商处获得的引物或 Assay。他们假定，发表 qPCR 数据的研究人员已经从自己研究的同类材料（特定细胞或组织）中验证了引物或Assay，但这往往是不正确的推论（Wang 等，2012年）。从供应商处购买的引物往往是在实验室中设计的，没有提供验证数据，这不符合 MIQE 准则（Bustin 等，2011年）。鉴于数据的质量和准确性完全取决于引物在每个反应中的扩增行为，新获得的检测方法应使用具有代表性的 DNA 样品对退火温度、特异性、可重复性、扩增效率和线性动态范围进行全面验证（Taylor 等人，2010年；Mikeska 等人，2009年）。

具有温度梯度功能的 qPCR 仪器将大大方便这些验证步骤。此外，引物的验证与样品类型（如细胞系或组织类型）、RNA 提取方法（如柱式提取与 TRIzol 提取）、预混液以及所用的逆转录酶 (RT) 试剂盒有关。当这些参数发生变化时，应始终进行独立的引物验证，以避免基因表达结果不准确的风险、错误的实验结论（Opel et al，2010）。

首先，让我们从 qPCR 数据分析的关键理论假设开始，即每个循环的模板量是前一个循环的两倍，这也可以表示为100%的扩增效率。但这种情况并不总是发生！ 比如，引物和探针设计不当会导致：

所有这些都会导致扩增效率低下！但我们如何知道引物/探针设计是否不当，需要再优化呢？这就需要用到我们接下来要分享的内容了。

PART 1:验证寡核苷酸的设计 

理想的序列覆盖率和最大同一性应为100%。BLAST 返回的每条 align 结果都会进行评分，并分配一个统计意义度量，称为 "期望值"（E-value），它是偶然发现匹配的概率指标。E 值是一种被广泛接受的评估潜在生物关系的指标。E 值越小，表示存在潜在生物学关系的可能性越大。E 值等于或小于0.01的序列通常被认为是同源序列。

图1. 通过 BLAST 算法验证扩增子的特异性

PART 2: qPCR assay 特异性验

当 PCR 扩增反应完成后，通过小幅度升温并监测每一步的荧光信号，典型的熔解曲线大约在 65-95°C 之间，以 0.5°C 为增量，在每个温度下保持若干秒来读取荧光信号。随着升温，dsDNA 的变性解链，插入荧光染料的脱离，荧光强度会逐渐下降，当达到与扩增子长度和 GC 含量相关的扩增子 Tm 时，荧光强度会突然下降。通过绘制荧光的负一阶导数与温度的关系图（-d(RFU)/dT vs. T，荧光强度变化率），就会在给定每个扩增片段的特定熔解温度Tm处出现一个峰值（图 1）。

图2.典型的熔解曲线分析

图2. 熔解曲线分析。A) 运行熔解曲线分析以确定 PCR 产物的熔解温度 (Tm)。B) 要确保引物对只扩增出一个产物，且不产生引物二聚体，就必须有一个单一的熔解峰。产生次级产物或引物二聚体会改变 qPCR 的扩增效率，并影响结果的准确性、精确性和可重复性。

注意，熔解曲线分析可用于检测所有的双链PCR 产物，包括非特异性产物和引物二聚体：

当这些双链非特异性产物在反应中扩增时，插入染料也会与之结合，从而导致 qPCR 反应的荧光强度增加，使反应效率超过100%。反过来，删除又会导致 Cq 值低于预期，靶标 DNA 的估计值过高，从而影响结果和结论的准确性。

熔解曲线中出现多个峰可能表示引物特异性、DNA 交叉污染、引物二聚体或基因组 DNA 污染等相关问题。

图3.可能出现引物二聚体的熔解曲线

因此，在未知样品、无模板对照 (NTC) 对照、无反转录酶 (NRT) 对照以及阳性和阴性对照样品上运行熔解曲线以确保含靶标的样本检测到单峰是至关重要的。

在验证引物对时，建议在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上运行 qPCR 结束后的扩增产物。这种方法可判断每个引物对是否只扩增出一个产物，且扩增的扩增片段大小与理论上的扩增片段大小是否一致。

图 4. qPCR 检测扩增的扩增子图像

将 PCR 反应的扩增产物上载到 10%丙烯酰胺凝胶，以验证扩增子大小是否与理论扩增子长度一致。没有任何次级产物证明引物对只扩增了一个扩增子。

可以对 PCR 产物进行测序，以确认引物确实扩增了感兴趣的靶标片段，这样可以避免引物扩增出与原始设计无关的产物，以下情况可能需要测序：