如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来-6（1）

除了依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶活性（其活性依赖于引物，并且需要镁或锰等辅助因子）之外，RT 酶还具有对研究人员非常重要的其他特征。这些特征包括 DNA 依赖性 DNA 聚合酶活性和 RNase H 活性，后者能降解 RNA：DNA 杂交链中的 RNA 模板。与典型的 DNA 聚合酶不同，RT 缺乏校对功能，它们的存在会抑制 PCR 实验中的 Taq 聚合酶在反应中的功能，导致结果不准确。

目前 RT-qPCR 中的 RT主要分为2种技术手段：即两步法和一步法。

反转录和 PCR 扩增过程分别在≥2个反应管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件以及引物策略。两步法 RT-PCR 首先用反转录酶合成 cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 PCR，即RNA反转录与 PCR 扩增分两步进行。如果需要 cDNA pool，再通过 PCR 或  qPCR 对多个转录本进行研究，最好采用两步法。

把反转录与 qPCR 扩增结合在一起，使反转录酶与 DNA 聚合酶在同一管中，处于同一个缓冲液中，靶标序列的反转录和 qPCR 扩增在同一反应孔或容器中进行。反转录和 PCR 都使用靶标特异性引物，而不是随机六聚体或Oligo（dT）引物。

反转录酶（RT）是一种依赖 RNA 的 DNA 聚合酶，可将单链 RNA 转录为 cDNA。所有已知的反转录酶都由反转录病毒编码，在体内的作用是将病毒 RNA 基因组复制到 DNA 中，然后再整合到宿主细胞中。最早分离出的反转录酶是来自禽骨髓母细胞病病毒的 AMV 和来自莫罗尼鼠白血病病毒的 MMLV，原始形态下，二者的大致区别如下：

2.1 AMV RT 酶

由两个亚基组成，需要6个 10mM 的二价阳离子才能达到最佳活性。与其他类型的 RT 相比，它的合成能力更强，最佳活性温度范围更高，因此更适合反转录二级结构较强的RNA。不过，AMV RT 的 RNase H 活性相对较高，不太适合合成长转录本。

2.2 MMLV RT 酶

由单个亚基组成，无 DNA 核酸内切酶活性，RNase H 活性较低。由于这些特性，M-MLV RT 常用于合成长转录本，其最佳活性温度为 37°C。目前已开发出许多 M-MLV 异变体，包括 RNase H 点突变体，其结构域往往因点突变而减弱或失活，使得恒温性更强，能耐受更高的温度，非常适合难处理的模板。

如今开发出了在高温下稳定的耐高温 RT 酶， RT 甚至可在高达 65°C 的反应温度下进行，这可消除任何 RNA 次级茎环结构，使反转录引物更容易退火到模板 RNA。

2.3 Tth 聚合酶

它是一种恒温酶，在锰存在下作为 RNA 依赖性 DNA 聚合酶起作用，但在镁离子存在下作为 DNA 依赖性 DNA 聚合酶起作用。

2.4 反转录酶的 RNase H 活性

对于 RT-qPCR，RNase H+ 反转录酶也具有独特的作用，它可以改善 qPCR 扩增，因为在 PCR 的第一个循环中切割 RNA 模板并增强 RNA-cDNA 双链体的解链，这可以防止 RNA 模板抑制 qPCR 扩增（模板抑制），从而提高灵敏度，另外随着mRNA的降解， RNase H活性可确保 RNA 一对一地转化为 cDNA 分子，得到的 cDNA pool 更能代表 mRNA 真实的分布和表达量（确保 mRNA：cDNA 的比例为1:1）。虽然以牺牲了更高的 cDNA 量为代价，但对于获得更准确的基因表达分析结果是非常重要的。因此 RNase H+ 活性能控制 RNA : cDNA 比率，在扩增效率一致的情况下，能够真实反应原始 mRNA 中基因丰度 / 表达量等信息。

一般来说，当合成长 cDNA 链时，两步 RT-qPCR 方案会受益于 RNase H+ 的活性。而在一步式 RT-qPCR 反应中，通常合成的是短 cDNA 链，模板抑制现象并不常见。Bio-Rad 提供具有 RNase H+ 活性（如 iScript 反转录试剂系列）或 RNase 活性降低（如 Reliance 选择 cDNA 合成试剂盒）的一步式和两步式 RT-(qPCR) 选择。

那么，哪种 RT 酶最适合您的 RT 反应？哪种酶的 RT 产率最高，能完全反转录起始 RNA？遗憾的是，研究表明，没有一种通用的 RT 酶总能在所有 mRNA 反转录中显示出最佳效果。所有 RT 酶都显示出不同的 RT 产率和不同的对 mRNA 二级结构的敏感性。从某种意义上说，qRT-PCR 实验的结果在很大程度上取决于 RT 的效率，而不是 PCR 的扩增效率。最好的 RT 酶能产生最高的 cDNA 产量，能完全反转录所研究的所有 RNA，并且不会给 cDNA pool 带来偏差或错误。

小结：