我们在《如何使用 qPCR 技术成功的开展基因表达分析实验-上》中提到正式开展实验前需要进行设计 qPCR assay，并对其进行质量控制，也即优化和验证。首先，小编将为大家介绍如何进行 qPCR assay 的设计，共分为4期，本期为第3期。
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五. 建立PCR反应体系并验证
5.1 选择荧光标记基团
qPCR 产物的检测需要使用荧光标记，可以直接标记扩增子，也可以通过标记探针进行检测。荧光标记试剂大致可分为两类：基于插入染料、基于核酸探针。
基于染料的 assay 依赖于 DNA 结合染料，这种染料与双链 DNA（dsDNA）结合时比未结合时发出更强的荧光，如 SYBR® Green、EvaGreen® 和 SYTO™ 染料。基于染料法的检测只需在 PCR 母液中加入引物，因此成本效益高，设计也相对简单。
但是，插入染料会检测反应中产生的任何 dsDNA，如非目标和非模板扩增或引物二聚体，从而可能导致定量不准确。可在 PCR 后进行变性（熔融）分析，以区分靶上产物和非特异性产物，或进行基因型分析。基于染料的 PCR 无法进行多重检测，因为在 PCR 循环过程中无法区分不同的扩增子。
图12.染料法荧光检测示意图
基于探针的 assay 除了 PCR 引物外（或作为引物的一部分）还使用序列特异性寡核苷酸探针，如 TaqMan 探针、Molecular Beacons 和 Scorpions 探针。这提高了检测的特异性，因为只有目标扩增产物才能被检测到。脱靶扩增反应仍有可能发生，并有可能导致荧光信号减弱和灵敏度降低。此外，探针还可用于多重检测，即用设计有独特荧光基团的探针靶向不同的扩增子，并在 qPCR 设备中使用单独的通道进行检测。对这些特定探针的要求可能会增加检测成本，但反过来，有效的多重检测可以大大提高检测通量并降低成本。
图13.探针法检测示意图
最常用的探针是水解探针（如 TaqMan 探针），它依赖于 Förster 共振能量转移（FRET），当探针完好无损时，通过3'淬灭剂防止5'-染料分子标签发出荧光。探针对 qPCR 引物下游的序列具有特异性，在 qPCR 循环的退火步骤中与 ssDNA 结合。在引物延伸过程中，Taq DNA 聚合酶的5'至3'核酸酶活性会导致探针水解，并使染料和淬灭剂的空间距离增大，从而使报告分子发出荧光信号。
探针的5′核苷酸不能是鸟嘌呤，因为鸟嘌呤会淬灭探针的荧光，影响检测的灵敏度。水解探针的最大长度应小于25个碱基对，因为过长淬灭效率会降低，背景荧光会开始上升，从而再次影响灵敏度。如有必要，可以降低引物的 Tm，从而使用更短的探针。此外，最好选择含有胞嘧啶多于鸟嘌呤的探针，而且一排中的鸟嘌呤不应超过三个。探针的 Tm 应比引物的 Tm 高 10ºC（约 68-70ºC），这是为了保证探针先于模板结合，但完全可以设计出不适用该规则的检测方法，比如上面提到的 Molecular Beacons 和 Scorpions 探针。
两种荧光标记方法的比较
5.2 DNA聚合酶
选择热稳定 DNA 聚合酶可在很大程度影响或决定扩增效率、特异性和灵敏度。Taq DNA 聚合酶最常用于 qPCR 核酸扩增，但与所有聚合酶一样，它在低温下有残余活性。
在反应设置过程中，有时候引物会与模板发生非特异性退火，从而合成非特异性产物，导致在 PCR 循环过程中发生不必要的扩增。这种情况下可以尝试使用 "热启动 "酶，即在PCR反应过程前使酶失活，使用热启动酶的 PCR 方案通常是在热循环前≥95°C 的初始变性步骤中激活。这种酶可以是单克隆抗体，也可以是在加热时结构发生变化的化学分子，与化学热启动技术相比，抗体热启动机制更具优势。在某些抗体热启动技术中，多个单克隆抗体在室温下使 Taq 聚合酶失活。
图14.热启动聚合酶工作原理
抗体可确保酶在 55°C 以下完全失活，然后在加热时发生不可逆转的变性，不会抑制 PCR。尽管 Taq 聚合酶在分子生物学中应用广泛，但也有大量的替代酶或突变体可用。一些热稳定聚合酶具有校对活性，可校正合成的 DNA。由于 qPCR 的扩增子通常较短，因此通常不需要高保真酶，除非打算对 PCR 产物进行下游测序。使用水解探针进行扩增检测时，DNA 聚合酶必须具有探针水解所需的5'至3'核酸酶活性。
5.3 Mg2+浓度
通常情况下，qPCR 需要更高浓度的 Mg2+ 才能获得最佳结果。以下的研究分析了 Mg2+ 浓度对扩增效率的影响，制备了4种 Mg2+ 浓度（1.5、2.25、3和 4mM）的重复反应，每种反应的最终引物浓度为 300nM。反应条件为 1.25 U Platinum Taq DNA 聚合酶和 1x PCR 缓冲液、0.2mM dNTP 和 SYBR Green I。
镁离子浓度对 PCR 反应的扩增效率有显著影响。3mM Mg2+ 浓度的 PCR 扩增效率最高（表1）。图15清楚的说明了保持高扩增效率的重要性。当 MgCl2+ 浓度从 1.5mM 增加到 3.0mM 时，104拷贝的 Cq 移动了4.7个 Cq，107拷贝的阈值 Cq 移动了3.6个 Cq。在 2.25mM 或 4mM Mg2+ 样品中没有观察到 Cq 的这种明显变化。
表1.不同 Mg2+ 浓度下测定的斜率、
扩增效率和相关系数
图15. 104个拷贝（上图）或
107个拷贝（下图）的环嗜血素靶标扩增曲线
上图，3mM 时 Cq=22.5±0.12；1.5mM 时 Cq=27.2±0.23。
下图，3mM 时 Cq=12.6±0.06；1.5mM 时 Cq=16.2±0.13。
两个实验均在同一块反应板上同时运行，使用相同的质粒稀释系列。左侧曲线是在 3mM MgCl2 浓度下生成的，右侧曲线是在 1.5mM MgCl2 浓度下生成的。
5.3引物/探针浓度
最佳的 qPCR 扩增结果可能需要确定引物和探针的浓度。每个引物的最终浓度为 300-400nM，探针的最终浓度为 250nM，这对大多数反应都是有效的，尤其是在靶标含量丰富且不需要最高灵敏度的情况下。引物浓度可在100至 900nM 之间进行优化，以提高反应效率和特异性。在某些引物/探针系统中，提高启动与探针互补的目标链合成的引物浓度可以改善荧光信号。使用染料检测时，较低的引物浓度可减少非特异性扩增。
大多数检测可使用 250nM 的最终探针浓度。不过，如果不需要很高的灵敏度，使用较低浓度的探针即可，从而降低检测成本。如果需要优化探针条件，在最终浓度为 50-250nM 的几个浓度下进行测试，并结合引物的优化浓度和最终实验中预期包含的靶标核酸的最低浓度。
优化引物（和探针）浓度是设计稳健 assay 的重要一步。重复之间缺乏重现性和检测效率低下都是效果不佳的表现。通常在100-900nM 的范围内使用不同的引物浓度测试检测性能。选择 Cq 最低、技术重现性最好的浓度组合。
图16 优化水解探针检测 PCR 引物浓度的典型实验结果。MIQE 建议对各种正向（F）和反向（R）引物浓度（通常为 50-900nM，如图所示）进行组合测试，以确定检测的最佳浓度。在本实验中，900nM 的正向引物和 300nM 的反向引物组合被选为最佳组合，因为该组合代表了最低的引物浓度，可重复产生最小的 Cq 值，同时保持了 S 型扩增曲线，重复间的差异极小。
图16.优化水解探针检测 PCR 引物浓度的
典型实验结果
建议对各种正向（F）和反向（R）引物浓度（通常为 50-900nM，如图所示）进行组合测试，以确定检测的最佳浓度。在本实验中，900nM 的正向引物和 300nM 的反向引物组合被选为最佳组合，因为该组合具有可重复产生最小的 Cq 值，同时保持了 S 型曲线，重复之间的差异极小的最低的引物浓度。
5.4模板上样量
qPCR 只能在感兴趣的模板区域能完全扩增且没有阻滞、缺口或断裂时才能得到有意义的结果。因此， DNA 或 cDNA 模板必须具有适合扩增的特征，没有损伤或缺失位点。此外，DNA 提取过程中的一些添加剂/成分或样本中的携带抑制剂也可能会抑制 DNA 聚合酶。
qPCR 可在6至8个数量级的宽动态范围内检测上样模板浓度。DNA 模板的复杂度越高，则给定 DNA 数量中的目标拷贝数就越少。一般来说，建议的上样量约为 100pg-100ng gDNA 或 cDNA（相当于 1pg-100ng 总 RNA）。对于低复杂度模板，如质粒 DNA、病毒（如绵羊噬菌体）DNA 或细菌人工染色体，建议每个反应的上样量范围在 1 pg-10 ng 之间。增加上样量可提高灵敏度，但也会增加反应中潜在 PCR 抑制剂的浓度。
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成分 |
推荐浓度 |
优化的范围 |
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引物 |
300-400nM |
100-900nM |
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探针 |
250nM |
50-250nM |
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Mg2+ |
3nM |
3-6nM |
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模板上 样量 |
10-1000copies |
1pg-100ng cDNA 100pg-100ng gDNA |
5.5 PCR 热循环条件
图17.典型的 qPCR 扩增程序（protocol）
应遵循所选 PCR 预混合母液所推荐的 PCR 循环条件。如果使用热启动酶进行 qPCR，以防止反应设置过程中出现非特异性扩增，通常需要一个初始变性步骤。对于抗体介导的热启动酶，在 95°C下进行30秒的初始变性步骤通常能使酶完全活化。这种热启动步骤也有利于长模板或具有重要二级结构的模板的完全变性。扩增 cDNA 模板时，通常初始变性时间不超过3分钟。扩增基因组 DNA 或超螺旋质粒 DNA 目标物时，延长初始变性步骤（5-10分钟）以使模板完全变性和片段化可能会有好处。
在初始变性后，PCR 在变性、退火和延伸的循环中进行。在变性过程中，高温孵育将 使dsDNA 解链成单链并形成松弛二级结构。GC 含量高的 DNA 或二级结构明显的 DNA 可能需要更长的变性时间。退火步骤是互补序列杂交的步骤，也是 assay 优化的关键点，因为退火温度可决定引物结合的特异性。退火温度可根据引物的熔化温度（通常比引物的 Tm 低 5°C）计算，再通过温度梯度对给定引物对进行经验优化。互补 DNA 链的合成在延伸步骤中进行，通常在 70-72°C 左右，以获得最佳的 DNA 聚合酶活性。
延伸时间取决于扩增子长度和 qPCR 仪器对最小数据采集时间的要求。68至 72°C 延伸步骤30秒适合大多数应用。但是，大于 200 bp 的扩增子可能需要更长的延伸时间。对于小的扩增子，如果引物的 Ta 合适，退火和延伸步骤可以合并，但有些引物对可能需要三步法的热循环才能达到最佳性能。
由于不同的检测方法在整个循环中的荧光信号会有所不同，因此在 PCR 热循环的正确时机检测荧光信号也很重要：对于染料检测和水解探针，荧光检测应在延伸步骤的末尾；对于杂交探针，荧光检测应在退火步骤中。不建议在高温（80°C）采集数据，虽然该方法可用于掩盖引物二聚体和/或其他非特异性产物的检测，但它对提高检测特异性或灵敏度的作用甚微，不能替代有效的引物设计。
5.6 引入尿嘧啶 N-糖基化酶 (UNG) 消除潜在的污染
对于定期进行 qPCR 的实验室来说，残留的PCR 产物会带来污染风险。如果用 dUTP 代替 dTTP 混合 dNTP 进行 qPCR 反应，所有 PCR 产物都将含有尿嘧啶（U）而不是胸腺嘧啶碱基 (T）。因此，可以用尿嘧啶 N- 糖基化酶处理模板 DNA，以特异性的消化含有尿嘧啶的 DNA（残留的 PCR 产物）。模板 DNA 含有胸腺嘧啶（T），不含尿嘧啶（U），因此不会被降解。
图18.热敏 UDG 酶的作用原理
有些 PCR 预混合母液含有热稳定 UNG 酶，这一过程简化了 qPCR 工作流程。使用含有 UNG 和 dUTP 的母液，qPCR 反应的设置与正常反应相同。在 PCR protocol 开始时加入 42°C 孵育步骤，在此步骤中，UNG 将消化潜在的、污染的含尿嘧啶的 DNA，这些污染物来自之前用 dUTP 进行的 qPCR 反应。然后，在 qPCR 反应的高温初始变性步骤中，此时 UNG 失活，防止降解当前 qPCR 产物，确保只检测到来自靶标模板 DNA 的信号。
5.7 消除可能的 PCR 抑制物
gDNA 或 cDNA 样品中可能存在酶抑制剂。DNA 和 RNA 的提取和纯化需要使用有机溶剂（如乙醇）和混沌盐（如胍），但这些物质会通过与酶或反应辅助因子的直接作用抑制酶反应。
此外，如果样本中含有不同程度的抑制剂，样本之间的比较可能不够准确。使用能最大限度减少抑制剂残留的 DNA/RNA 抽提方法可以缓解这些问题，但并不总是可行的。在这种情况下，选择耐抑制剂的预混液就十分重要。
未完待续
敬请关注“如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来”系列文章，教会您如何在 MIQE 的指导下开展 qPCR（RT-PCR）实验，获得可靠的实验结果。
下期预告：
《qPCR assay 的设计（4）》，敬请期待~
参
考
资
料
[1] Bustin, Stephen, and Jim Huggett. "qPCR primer design revisited." Biomolecular detection and quantification 14 (2017): 19-28.
[2] MIQE qPCR & dPCR How to apply the MIQE guidelines - a visual, interactive and practical qPCR & dPCR guide 5th Edition (20th February 2022)
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