Western实验中内参是必不可少的，通常我们会使用管家蛋白如actin、tubulin或GAPDH作为内参来确保每个泳道上样量的一致，所以这些内参也被称为上样控制（Loading Control）。通过loading control的信号来指示泳道上样量的差异，指导Western实验者调整每个泳道的上样量，以确保目标蛋白条带的变化是真实可靠的。
当管家蛋白提示我们泳道上样量需要相应调整时，我们真的需要相应调整泳道上样量吗？
我们是否常常遇到这种情况：不调平管家蛋白时，目标蛋白的信号趋势符合预期；然而，根据管家蛋白信号调平后，目标蛋白信号却与预期结果不符……
可以作为内参的标准之一就是能够敏感且线性的反应泳道的真实上样量差异，但是管家蛋白的表现往往不那么理想。文献“Stain-Free total-protein normalization enhances the reproducibility of Western blot data”中非常清楚的展示了不同内参导致的Western定量差异：actin内参导致了与Stain-Free内参不同的定量结论。
如果以actin作为内参，在3组重复实验中，会得到目标蛋白FoxP1表达无显著差异的结论。以Stain-Free为内参，则会得到有极显著（p<0.0001）的结论。
那么出现这种定量结论差异的原因在哪里？作者给出的其中一个因素就是内参的线性及精密度。研究论文中，比较了Stain-Free与actin、tubulin及GAPDH的线性差异：相同的样品，以不同上样量进行Western实验，考察4种内参的线性理想程度。
从结果可以看出：
Stain-Free与actin的线性响应最接近理想状态，而GAPDH与tubulin的动态响应与理想状态有一定差异。
Actin、tubulin与GAPDH信号方差较大，而Stain-Free信号的方差较小，信号精准度更高。
比较actin与Stain-Free内参定量的结果，我们可以看到actin在3组重复实验中，其定量数据的差异性非常大（表达差异从-12.3%到+92.7%），最终三组综合数据的结果是没有明显FoxP1表达差异。以Stain-Free作为内参，定量数据非常稳定（增加19.1%到35.9%）。Stain-Free精准的定量结果与实验理论预期也是一致的（干扰E3连接酶后，FoxP1表达量上调）。
可见Stain-Free不但可以理想、灵敏的反映出泳道上样量的差异，而且其定量结果的精密度也远远高于传统的管家蛋白。在目标蛋白表达量差异比较微小时，给出更为精准的Western定量结论。
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