◎终极 qPCR assay 设计指南◎
1
扩增子长度在 70-150bp。
2
引物 GC 含量为 40-60%。
3
避免单个碱基连续(4+)重复序列。
4
确保引物的熔解温度在 50-65°C 之间。
5
避免在具有二级结构的区域设计引物，使用 MFOLD 等程序绘制靶标序列的结构预测图。
6
如果要评估真核细胞中的基因表达，请将引物设计在跨外显子-外显子交界处，以避免扩增来自纯化步骤中可能引入的污染基因组 DNA。
7
检查正向引物和反向引物的3互补序列，因为可能会有引物二聚体的形成。
8
使用任一在线工具（如 Primer-BLAST）验证特异性，以确认感兴趣的靶标是唯一的。
1
设计探针熔点比引物高 8-10°C。
2
在大多数应用中，探针应≤30个核苷酸。如果探针较长，可考虑使用内部淬灭剂。
3
确保探针的5‘末端不含 G。如果5‘末端存在 G，即使在水解后也能淬灭荧光。
4
如果要评估真核细胞中的基因表达，请将探针或引物设计成跨越外显子-外显子连接点的探针或引物。
5
通过 Primer-BLAST 运行探针序列比对工具，以确保该序列对您感兴趣的靶标是唯一的。
1
遵循最大限度减少污染的最佳实践指南。
2
确保移液器校准正确。
3
使用无模板对照验证反应体系无污染。
4
准备足够的预混液（额外+10%）来配置您的所有反应体系。
5
准备技术重复时，将模板添加到预混液母液中，而不是单个反应孔中。
6
避免移液少于 5µl。
1
戴手套并在专用的 qPCR 区域工作。
2
使用带螺旋盖的管子制备模板。
3
始终使用专用移液器进行 qPCR。
4
使用防气溶胶带滤芯的吸头。
5
使用 PCR 级水。
6
使用10%漂白剂清洁工作台，不要用乙醇！乙醇只会沉淀 DNA 并将其散布在表面上。
7
实验过程中始终包含无模板对照。
◎9个潜在陷阱(以及如何避免它们)◎
使用降解的RNA
说到 qPCR，垃圾进 (garbage in)=垃圾出(garbage out)。降解或受污染的 RNA 会产生低质量的 cDNA，从而导致 qPCR 扩增效率低下，并产生不准确的低质量数据。
如何避免
通过凝胶电泳或生物分析仪分析评估 RNA 质量。
分别移取反应组分
qPCR 的扩增效率在很大程度上取决于反应容器内的各化学成分，因此每个反应都必须在完全相同的化学环境中进行。分别移取各组分会产生变异和误差。
如何避免
制备含有所有反应成分（除模板外）的预混液母液，充分混合并分配到每个反应孔中。
准备足够满足配置所有反应的预混液母液，并额外多准备10%，以预防可能出现的移液误差。请勿冷冻和重复使用。
引入交叉污染
如果操作 PCR 管时不小心，扩增 DNA 很容易气溶胶化。进入反应容器或试剂中的污染物会影响最终数据，产生与生物学研究无关的结果。
如何避免
戴手套并在专用的 qPCR 区域工作。
使用带螺旋盖的管子制备模板。
始终使用专用移液器进行 qPCR。
使用防气溶胶带滤芯的吸头。
使用 PCR 级水。
提前计算好 PCR 成分，最好一次性使用完毕。
用10%漂白剂而不是乙醇清洁工作台。
实验过程中始终包含无模板对照。
忘记增加对照
如何知道靶标序列是否被正确扩增？如果没有对照，您就无法确定检测的特异性和准确性，也无法在出现问题时排除故障。
如何避免
无模板对照: 不添加样品，作为外源核酸污染的对照。
无逆转录（RT）对照: 以无反转录酶合成 cDNA 的样品作为模板，每次检测都设置1个。
NA 质量控制: 使用 RNA 质量检测来验证 RNA 的纯度和完整性。
阳性和阴性对照: 在反应中加入合成模板，以证明反应条件没问题。在阴性对照中不添加 DNA 聚合酶，以评估背景荧光信号。
阈值设置过高或过低
如果阈值设置在 PCR 反应的指数增长阶段之外，Cq 值将无法准确反映样本中的 DNA 浓度，其结果与生物学无相关性。
如何避免
如果反应板包括连续梯度稀释液，请将阈值调整到达到标准品最大相关系数（R2值）的位置。
如果反应板不包含连续梯度稀释，则将阈值置于指数扩增期，高于背景信号噪声但低于平台期。
未能优化和验证检测方法
要在 qPCR 检测中实现准确的模板定量，每个反应都必须有效的扩增出单一产物。扩增效率不能受以下因素的影响：
• 模板浓度
• 其他模板的扩增
• 样本中潜在的污染物
即使采用商业化检测试剂，也应进行验证。
如何避免
一定要验证新的 qPCR 检测方法，以验证其在测试条件下的扩增效率。
使用5个数量级（5倍或10倍稀释）的标准曲线确定 PCR 扩增效率，且每个梯度重复三次，以确定 assay 的扩增效率、线性动态范围和重现性
◆ PCR 的扩增效率应为 90-110%
◆ 标准曲线的 R2 应大于 0.98
◆ 重复样品的 Cq 值相差不应超过0.2个标准差单位（Cq 值）
通过测试不同温度下的扩增效率和重现性，确定最佳退火温度
通过熔解曲线验证检测方法的特异性
使用不正确的标准梯度稀释范围
来验证扩增效率
标准曲线用于确定 qPCR 检测方法的扩增效率、线性范围和重现性。这些值仅对用于生成标准曲线的系列梯度稀释内的浓度范围有效。如果样品的 Cq 值超出了系列稀释液的 Cq 值范围，则不能推断线性范围以外的扩增效率。
如何避免
事先评估覆盖靶标预期浓度范围的一系列标准梯度稀释液
准备至少 5个数量级的连续梯度稀释液（5-10倍）
为每个梯度稀释液移取相同体积的 DNA
使用正确规格的移液器，尤其是小体积移液器
避免移液少于 5µL
在检测污染物的阴性对照中用 PCR 级的水代替 DNA
使用不稳定的内参基因
并非所有常用的参考基因在所有条件下都是表达稳定的。不确认参考基因的稳定性，可能会产生与所研究的生物学过程无关的结果。
如何避免
验证任何内参基因的适用性，确认其稳定性
运行一组常用内参基因的 panel，以确定最适合实验条件的内参基因
使用多个不因实验处理或条件而改变表达量的内参基因
忘记设置技术重复
对每个样品进行重复检测以评估测定方法的精密度和重现性，则才能对检测和实验过程有信心。
如何避免
每个样本至少重复三份
进行功效分析（power analysis），以确定需要多少个重复才能得到一定的倍数变化
◎qPCR Assay 的优化和验证◎
利用温度梯度功能优化引物 Ta
退火温度 (Ta) 必须足够高以确保引物的特异性，但又必须足够低以保证 PCR 的扩增效率
使用温度梯度功能测试引物在目标温度 Ta 附近的温度范围（例如，对于目标温度 Ta 为 60°C 的引物，测试温度为 55-65°C）
使用 SYBR® Green 运行熔解曲线以确保引物的特异性
选择 Cq 值最低而又不会产生非特异性扩增的 Ta（图1）
图1: 使用阳性对照样本，利用温度梯度进行引物的检测优化。在此例，61.4°C 是最佳温度，因为它是 Cq 最低时所对应的最高温度（此时 Cq 为 21，而更高温度对应的 Cq 为22和25）。
检查靶标 Ta 的熔解峰，确认是否存在一个高而尖的峰（图2）
图2: 熔解峰可验证引物对的特异性。特异性检测只会扩增一个 PCR 产物，因此只有一个峰。多个峰表有示多个产物，如非靶标扩增子或引物二聚体。纠正脱靶扩增可采用更高的 Ta，也可能需要重新设计引物。
通过标准曲线验证检测方法的扩增效率
对阳性对照样本进行 10 倍梯度稀释
对所有梯度稀释样品使用优化的引物 Ta 来运行qPCR
绘制 Cq 值与起始浓度对数的关系图，并生成最佳拟合线性图（图 3）
PCR 扩增效率 E=10(–1/slope)
% 扩增效率 =(E–1)×100%，范围在 90-110%
标准曲线的决定系数 R2>0.98
图3: 通过对模板 DNA 进行连续梯度稀释可生成标准曲线。DNA 模板数量的对数（x 轴）与 Cq 值（y 轴）之间存在负相关关系。根据标准曲线的斜率可计算出 PCR 扩增效率，并用于计算相对数量（Pfaffl 法）
使用探针进行多重检测：特别考虑
熔融曲线仅与 DNA 插入染料（如 SYBR® Green）兼容，不能与水解探针一起使用
多重检测需要一起验证，以确保避免 assay 之间的竞争（图 4）
图4: qPCR 多重检测必须同时进行验证和优化，以确保 PCR 检测效率不会因竞争而受到抑制。
参
考
资
料
* BIO-RAD是BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。
* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。