《JCB》论文揭示 GPI 锚定蛋白分泌及错误折叠翻转机制

分泌路径蛋白质稳态是细胞和有机体健康的基础，蛋白质稳态 (proteostasis) 是指细胞内蛋白质的合成、折叠、修复、降解和运输等过程的平衡状态，保证细胞内蛋白质数量、构象和功能处于稳定的状态。分泌路径是蛋白质转运的重要途径之一，分泌路径是内质网 (ER) 和高尔基体(Golgi)、溶酶体 (Lyso)、质膜 (PM) 以及胞外等的蛋白质折叠、修饰和质量控制系统。分泌路径底物包括跨膜、可溶性及糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定蛋白(GPI-AP)，该蛋白在分泌至细胞膜表面前于内质网中合成、折叠和加工。这个过程的核心困境是蛋白质折叠容易出错，并且偶尔会产生有毒的错误折叠构型。为了维持最佳的细胞功能，内质网伴侣和酶 (统称为“内质网蛋白质质量控制 (PQC)”) 监测蛋白质折叠并处理错误折叠产物。通过帮助蛋白质折叠，或丢弃错误折叠的蛋白质，ER PQC 维持ER内蛋白质的动态平衡。

主要的 ER 清除途径，包括 ER 相关降解 (ERAD)、ER 自噬 (ER-phagy）和其他 ER 至溶酶体相关降解（ERLAD）途径，可防止错误折叠的分泌蛋白或膜蛋白进入细胞表面。ERAD 途径通常涉及 p97 介导的错误折叠蛋白从 ER 逆转运到胞液，以便被泛素蛋白酶体系统降解，而 ER 吞噬和其他 ERLAD 途径包括通常通过脂化 LC3 的参与，囊泡直接从内质网转运至溶酶体进行降解。相比之下，越来越多的证据表明，错误折叠的 GPI-AP，包括人类疾病的朊病毒蛋白（PrP）突变体，不能通过 ERAD 或 ER 吞噬途径在 ER 处有效降解，而是在溶酶体降解之前通过ER输出至高尔基体。内质网输出到高尔基体进行下游溶酶体降解是组成性的和内质网应激期间。此外，在哺乳动物细胞中，错误折叠的 GPI-AP 在组成型和 ER 应激诱导的周转过程中能够进入细胞表面，这可能会帮助了解朊蛋白的错误折叠。然而，错误折叠的底物是如何从内质网中释放出来的，目前尚不清楚。

美国健康科学统一服务大学的研究者在《Journal of Cell Biology》上刊文研究了在正常稳态条件下，是什么调节错误折叠的 GPI-AP 从 ER 中释放以进行 RESET，以及在新 ER PQC 底物的急性上调过程中如何加速这种释放。研究数据强烈表明，钙连接蛋白（CNX）是一种内质网定位的伴侣蛋白，有助于新合成的 N 连接糖蛋白的折叠，是错误折叠的 GPI-AP 的关键内质网保留因子。CNX的急性降解会导致错误折叠的 GPI-AP 快速释放以进行 RESET，而多种底物与 CNX 的结合会促进错误折叠的 GPI-AP 从 CNX 中释放，以在稳态条件下进行ER输出。研究结果还证明了与 CNX 结合的底物负载与用于ER输出的错误折叠 GPI-AP 的 Tmp21 依赖性释放之间的相关性。实验结果符合这样一个模型：即 CNX 结合的竞争在调节错误折叠的 GPI-AP 通过 RESET 途径的通量方面发挥着关键作用。

实验中，为获得更为准确的 Western Blot 数据，研究者使用了 Bio-Rad 的 Stain-Free 总蛋白内参技术来定量细胞中表达的多种靶标蛋白，例如：αGFP、αTMP21、αCRT、αGRP94、αBiP、αCNX 等。作为普通看家蛋白内参的一种替代，Stain-Free 总蛋白内参可以提供更稳定的表达，不容易受到样品处理方式或样品类型的影响，提供一种更稳定可靠的上样量参考。与传统的考马斯蓝或丽春红总蛋白染色不同，Stain-Free 不需要额外的染料，仅需要不超过1分钟的紫外激发就可以对凝胶及印迹膜上的总蛋白进行呈现和定量，以确认泳道中的真实上样量差异。同时，Stain-Free 技术还兼容后续的抗体杂交实验，不需要重新跑胶或者转印，不增加 Western Blot 实验的操作步骤，也不需要额外更多的样品消耗。