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MIQE Star 有奖征集活动火热进行中,qPCR 高手速来

MIQE Star 有奖征集活动火热进行中,qPCR 高手速来 广州市昊洋贸易有限公司
2023-11-13
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马上要开组会了,小王同学愁眉苦脸,原来隔壁师兄因为被拒稿而延毕,起因是 qPCR 扩增曲线细节不符合标准,同病相怜的小王,究竟怎么才能让实验快速推进?(文中含惊喜福利

如果你觉得自己 qPCR 玩得飞起,那么 qPCR 界的老法师 Bio-Rad 可以帮你检验一下基本功,看你是否能够 100% 搞定 qPCR 实验。


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一、qPCR 实验整体流程包括哪几个关键步骤?



二、qPCR 实验常见技巧?



(左右滑动查看更多)

三、qPCR 实验常见问题?





3.1 Cq 值出现较晚,明显偏大(> 35)



1)模板量低或基因表达丰度低:建议增加模板量观察 Ct 值,观察其能否成相应倍数减少。


2)模板降解:重新制备扩增模板,重复实验。


3)qPCR 方法未优化或验证:整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低,建议通过标准曲线确认扩增效率。


4)扩增产物过长:建议用三步法程序扩增或优化引物,扩增产物长度最好不超过 300 bp。


5)反应体系存在抑制物:体系中可能存在抑制剂,影响酶的活性,建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。



3.2 熔解曲线出现双峰,杂峰 Tm 在 80 ℃ 之前



1)可能存在引物二聚体,建议降低引物浓度或重新设计引物等。


2)可能由于模板量过低,促使引物二聚体的形成,建议提高上样模板量。

如果前面的问题,你都答对了,那再考考你,知道 qPCR 实验的「圣经」——MIQE 指南吗?是不是被问住了。别急,下面老法师告诉你 MIQE 是什么。



向下滑动阅览

MIQE 指南(qPCR 实验发布的最低限度信息的英文缩写),发表于 2009 年[1],该指南规定了获得可靠结果所需的最低限度的关键实验参数和注意事项,这是一个涵盖最佳实践和常识性理论,目前是 《Clinical Chemistry》中被引用次数第二多的论文。


MIQE 是一套准则,对 qPCR 实验所需的最少信息提出了要求,主要是一份涵盖 RT-PCR/qPCR 实验全流程的检查表(checklist),通过记录和提供所有 qPCR 相关的实验条件和结果,从而确保高质量的 qPCR 数据。


总之 MIQE 的最终目标是建立一个明确的框架,在此框架内进行 RT-qPCR 实验,并为审稿人和期刊编辑提供一个公认的标准,用于提高实验数据的透明度,评估待发表文章的质量,使用这种广泛应用的方法将最终产生更一致、更有可比性和更可靠的数据。

敲黑板了!!!

为什么要关注 MIQE 指南呢?你是否曾经尝试过论文中的新方案,却以失败告终?你并不孤单。Nature 杂志在一项调查中发现[2],大多数科学家都无法重现他们论文结果。MIQE 指南将提供指导,以确保您的出版物包含 qPCR 实验所有必要的细节,从而为其他研究人员提供复制您的结果的最佳机会,彻底杜绝被拒稿和撤稿的风险。

令人期待的是,Bio-Rad 公司一直在大力提倡和遵循 MIQE 指南的原则和理论,并发展出一套符合 MIQE 指南的 RT-PCR/qPCR 全流程实验方法,涵盖从实验设计到数据分析等 6 大实验环节。

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[1] Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009 Apr;55(4):611-22. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797. Epub 2009 Feb 26. PMID: 19246619.

[2] https://www.nature.com/articles/533452a

* BIO-RAD是BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。

* 本产品仅用于科研用途,不用于临床诊断。

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