NGC 能力挑战赛
----液相层析系统的消毒挑战！
在开发生物制剂或生物治疗药物时，需要付出大量努力来确保纯化后样品没有污染或有害残留成分。因此，这些纯化过程中使用的仪器需要额外的消毒步骤。那么面对多种不同来源的污染物或者样品，我们的 NGC 中高压层析系统会有怎么样的表现呢？
『符合 cGMP 的消毒要求』
在 cGMP 环境中，生物制药的小批量生产需要有效的消毒程序。验证设备的清洁度在制药行业中是必要环节，对于避免微生物、病毒、内毒素、清洁溶液残留物等污染药品至关重要。 我们使用 NGC 系统主动用三种微生物（大肠杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母））进行污染并进行重组蛋白的生产，之后进行 CIP 在线的清洗，并没有对仪器进行拆解清洗。24小时后，采集感染溶液样本以计算存活微生物的数量。采样后用 1 M NaOH 对 NGC 平台进行净化。使用20%的乙醇冲洗掉 NaOH。然后，用无菌 0.9% NaCl 溶液冲洗 NGC 平台，以获取存活微生物样本，随后使用不同的琼脂板进行测试。成功清洁过程的验收标准是菌落形成单位 (CFU) 至少减少 6 CFU/100ml，并且 10 ml 流出物中的绝对数量合计少于1 CFU。在大肠杆菌污染并用 NaOH 清洗后，进行内毒素水平测试。
－表 1. 用于污染和消毒实验的生物体－
『用大肠杆菌 -B13 挑战 NGC 系统』
在实验中，NGC 系统组件被一起感染，一式两份，并使用多个流路。去污后立即采集的样品显示 LBamp 板上没有生长迹象。净化后 24 小时重新取样表明没有特定细菌生长。在 YPD 和 LB 琼脂平板上都发现了不可重复和非特异性的菌落，且细菌生长少于 6CFU。
『用巴斯德毕赤酵母 – GS 115 和酿酒酵母 -INVSc1挑战 NGC 系统』
巴斯德毕赤酵母 -GS 115 和酿酒酵母 -INVSc1 实验一式两份进行。去污后未检测到活的巴斯德毕赤酵母 -GS 115 细胞。此外，在第一轮采样后 24 小时，用无菌 0.9% NaCl 溶液进行第二次洗脱后，没有看到特定的菌落。还使用与巴斯德毕赤酵母 -GS 11 5相同的洗脱方案对酿酒酵母 -INVSc1 进行了实验。在去污后24小时进行系统的第二次洗脱。所有样本的特定 CFU 检测均为阴性。
『通过大肠杆菌 -B13、毕赤酵母 -GS 115 和酿酒酵母 -INVSc1 的组合挑战 NGC 系统』
等体积混合，单个细胞计数如下：大肠杆菌 -B13，2 x 10 7 CFU/ml；巴斯德毕赤酵母 -GS 115，4 x 10 6 CFU/ml；酿酒酵母 -INVSc1，4 x 10 6 CFU/ml。系统被感染，24 小时后采集样本以确认 CFU 数据。所有三种生物体在这些条件下都生长得非常好，并且生物体的绝对数量对卫生处理方案提出了更高的挑战，而卫生处理方案没有改变。净化后立即用无菌 0.9% NaCl 溶液取样，120小时后再次重复取样。在这 120 小时内，NGC 系统储存在 0.9% NaCl 溶液中，而不是典型的 20% 乙醇中。120 小时后对第一次取样的琼脂平板进行检查。从缓冲液混合阀到进样阀废液位置的流路中，200 ml 中有 10 CFU（酵母）（5 CFU/100 ml）。在从柱切换阀到系统出口阀的流路中，在 450 ml 中发现了额外的 20 个 CFU（大肠杆菌-B13）（4.4 CFU/100 ml）。在这两种情况下，CFU 水平均低于生产注射用水 (WFI) 的 GMP 要求（10 CFU/100 ml）。尽管系统在 0.9% NaCl 溶液中放置120小时，但第二次取样的琼脂平板检查结果为阴性，并且没有观察到进一步的特异性生长事件。
『内毒素检测』
在项目过程中，NGC 系统多次用大肠杆菌 -B13 溶液进行处理。革兰氏阴性细菌（例如大肠杆菌 -B13）在细胞死亡时将内毒素释放到周围环境中。由于细菌内毒素是强效炎症因子，因此确保它们不会在层析系统中积聚至关重要。它们可以用 NaOH 等消毒剂去除。内毒素是非常稳定的脂多糖，可能需要清洁剂孵育长达 12 小时（表 2）。
－表 2.使用三个面板进行内毒素测试－
样品板包括 A（污染前）、B（NGC 系统被大肠杆菌 -B13 污染并用 NaOH 消毒 1 小时后）和 C（用 NaOH 消毒 18 小时）。采样是分段进行的（从左到右）。取样溶液为 0.9% NaCl。
现代层析系统（例如 Bio-Rad 的 NGC 系统）利用自动化流程来运行用户定义的系统清洁方法，非常简单高效，日程规律的进行系统清洗维护以及验证满足了 GMP 的要求。此次调整证明 NGC 层析系统的大量微生物污染可降至 1 CFU/10 ml 。用这些常见的微生物进行蛋白纯化并按照要求清洗消毒将不再担心系统污染问题。此次挑战结果，在极端的污染情况下，NGC 仍然表现出了很高的清洁效率。尽管在用大肠杆菌 -B13 和酵母混合物感染后检测到了一些微生物 CFU ，但 CFU 水平远低于 cGMP 规定的 10 CFU/100 ml。此外，还研究了内毒素的去除，并且与 NaOH 净化的孵育时间成功，孵育时间超过 1 小时，可以做到内毒素的高效清楚。
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* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。