为了应对 COVID-19 疫情，美国疾病预防控制中心（CDC）在2020年9月发布国家污水监测系统（NWSS）计划，旨在建设全国范围内追踪监测污水中 SARS-CoV-2 水平的能力，并针对污水监测的各个环节发布了操作指南，周期性更新。NWSS 启动近3年来来，取得了长足进步，我们对 NWSS 的具体内容做了调研，详见文章《WBE 实例：美国国家污水监测系统》。这些指南也经历了相对长时间的考验，证明目前阶段是可行的。接下来我们会针对各个操作指南最新版进行介绍，学彼所长。
需要注意的是，污水监测数据旨在补充其他 COVID-19 监测指标，为公共卫生行动提供信息。任何干预措施或公共卫生行动都不应仅仅基于污水的检测数据。
一、采样
二、样本处理
三、检测
目前有多种核酸检测方法和实验室工作流程可用于量化污水中的 SARS-CoV-2 浓度。良好的实验质控可以保证方法的性能和数据质量，确保不同方法间的可比性。根据污水中 SARS-CoV-2 的水平，可以调整方法以适应更高或更低的检测限。例如，如果污水中 SARS-CoV-2 RNA 的含量足够高，则可以对少量污水(例如1 mL)进行直接定量，而无需进行额外的浓缩处理。检测方法包括核酸检测、质量控制和生物安全措施，以确保数据可为公共卫生目的所用。
核酸检测
RNA 定量
利用 RT-qPCR (逆转录-定量 PCR )或 RT-ddPCR (逆转录-微滴数字 PCR，其他形式的数字 PCR 也是可行的，但不太常用)定量污水中 SARS-CoV-2 RNA。每种方法都可以通过一步反应(逆转录和 PCR 在同一反应体系中进行)或两步反应(逆转录和 PCR 在单独的顺序反应中进行)进行。一步法 RT- ddPCR 方案对污水检测是有优势的，因为逆转录在独立的微滴中进行，与两步法 ddPCR 和 RT-qPCR 使用的单一体系中逆转录相比，可以减少对逆转录的抑制。
检测靶点
引物探针结合区域已在文献中进行了报道，包括N基因（N1 和 N2，由 CDC 发表）和E基因（E_sarbeco，Corman et al., 2020 EuroSurveillance），其灵敏度和特异性足够用于污水中 SARS-CoV-2 RNA 的定量。如果可能的话，请使用相同的检测靶点比较不同的污水检测方法。
质量控制
质量控制对于比较不同时间和不同来源污水中的 SARS-CoV-2 RNA 浓度至关重要，特别是使用不同的测试方法时。国家 CDC 建议对 SARS-CoV-2 污水监测采用以下类型的质量控制:
基质回收控制
使用基质回收控制(也称为过程控制)来了解样品处理过程中丢失的病毒数量。这种控制对于比较不同检测方法和不同时间点样品中的浓度非常重要。因为污水在化学和生物学上是复杂多变的，通常含有可能干扰样品浓度、核酸提取或分子定量方法的成分，因此定量评估回收率是很重要的。方法验证中包括基质回收控制是必须的，如果可能的话，在每个样品中计算基质回收率，以监测污水成分的额外变化。当污水状态(如雨水流入)或实验室检测方法发生变化时，包含基质回收控制是必须的。
使用与 SARS-CoV-2 在生物学上更相似的物质进行基质回收控制，可能更准确地代表从污水样品中回收 SARS-CoV-2 的情况。基质回收对照的候选者是具有单链 RNA 基因组的包膜病毒，包括小鼠冠状病毒 MHV (也称为小鼠肝炎病毒)、牛冠状病毒 BHV 和牛呼吸道合胞病毒 BRSV。
人类粪便标准化
在计算趋势之前将污水样本中 SARS-CoV-2 浓度进行标准化，可以说明污水稀释度的变化和不同时间点人类粪便投入量的差异。如果预计在监测期间下水道中粪便的来源人数会发生变化(由于旅游、工作日通勤、临时工等原因)，那么通过污水中人类粪便的数量将 SARS-CoV-2 浓度标准化，对于解读 SARS-CoV-2 浓度和比较不同时间点污水样本之间的浓度很重要。人类粪便标准化控制是通过定量人类粪便特有的有机体或化合物来评估人类粪便含量。
人类粪便特有的有机体包括但不限于:
粪便指示病毒分子靶点:辣椒轻度斑驳病毒(Pepper Mild Mottle virus)、克拉噬菌体（crAssphage）
粪便指示细菌分子靶点:拟杆菌 HF183（Bacteroides HF183）、毛螺科Lachno3（Lachnospiraceae Lachno3）
使用人类粪便有机体使 SARS-CoV-2 浓度标准化(例如，SARS-CoV-2 与人类粪便浓度的比例)还可以解释从粪便进入污水系统到实验室定量之间任何地方发生的病毒损失。然而，人类粪便标准化不能取代基质回收控制进行检测方法的性能评价。
标准品质量控制
SARS-CoV-2 RNA 定量时必须使用标准品进行质量控制。对于 RT-qPCR，需要从已知浓度的标准品中导出校准曲线。对于 RT-ddPCR，需要检测已知浓度的标准品。对于精确的 RNA 靶标定量，RNA标准品优于 DNA 标准品。将标准品分装，储存在 -70°C 或以下，避免反复冻融。
抑制作用评估
使用抑制测试来确定 RNA 定量过程(逆转录和 PCR )是否按预期进行。污水的成分复杂多变，通常含有抑制物会干扰 RNA 定量，从而影响准确性。
可以使用下面几种方法评估抑制作用:
当 SARS-CoV-2 RNA 浓度较高时，通过评估样本梯度稀释后检测出的 RNA 浓度与稀释度是否相符来评估抑制作用。首选这种评估方法，因为它使用相同的检测方式，可以直接评估样品中的抑制作用。
当稀释后的 SARS-CoV-2 RNA 浓度过低而无法定量时，通过将病毒 RNA (例如，合成的 SARS-CoV-2 RNA 或从非人类冠状病毒中纯化的 RNA，如基质回收控制中所述)加入污水提取物中，并将定量的浓度与没有额外加入病毒 RNA (无模板对照)的样品进行比较，来评估抑制作用。
如果抑制作用显著，通常可以通过稀释样品来缓解。如果经常遇到抑制，需要进一步优化样品处理或定量方法。
阴性对照
提取空白对照指的是提取不添加污水样品（空白样品）的对照。这些对照用来检测提取试剂污染，需要包含在每组提取的样品中。
“无模板对照”（NTC）是指不添加污水样品核酸提取物的分子反应试剂。使用这些对照来检测分子试剂污染，并监测所有 PCR 仪器运行。
生物安全
从污水中浓缩 SARS-CoV-2 的过程中会产生生物气溶胶。国家 CDC 建议在具有单向气流和生物安全三级预防措施的生物安全二级 (BSL2) 设施中进行这些过程，包括呼吸保护和指定区域穿戴个人防护设备。来自可能含有 SARS-CoV-2 污水样本的实验室废物应按照 BSL2 生物安全指南进行高压灭菌和管理。
巴氏灭菌法
对污水样品进行高温巴氏消毒，以减少污水样品处理过程中产生气溶胶的生物安全风险。在决定是否采用巴氏灭菌时，应考虑以下因素:
高温巴氏灭菌对污水中 PCR 靶向的短 RNA 片段的破坏程度尚不清楚。
同行评议的报告发现，在 56ºC 下热处理呼吸样本 30 min，对 RNA 测量的变化可以忽略不计。
一些研究人员报告表明，在 60℃ 下对污水进行热处理可以改善 SARS-CoV-2 RNA 的测量，但需要更多的数据来证实这种效果。
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