续前文：
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反转录
反转录过程会给 RT-PCR 分析带来巨大的变异。因此，提交文章时必须详细说明 RNA 转化为 DNA 所采用的实验方案和试剂，包括被反转录的 RNA 的量、引物、酶的类型、酶的用量、温度和反应时间。反转录过程最好在相同的 RNA 浓度下进行 2-3 次重复，以保障实验结果的准确性。
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qPCR
发表 qPCR 文章时必须提供以下信息：
每个目的基因和参考基因的数据库检索编号；
每个引物和探针的外显子位置：
寡核苷酸的序列和浓度，包括染料或被修饰的碱基的性质、位置和连接；
聚合酶的浓度和性质；
模板 DNA 或 CDNA 的量；
镁离子的浓度；
缓冲盐中精确的化学组成(盐、pH 值和添加剂)及反应体积；
qPCR 仪和 PCR 温度循环条件。
塑料耗材：由于使用的塑料耗材会影响热循环，因此需要明确所用的每个 PCR 管、多联管或 PCR 板及制造商。还需要提供塑料耗材的透明度(如白色或透明)信息，因为不同的塑料对荧光的反射和敏感性不同。若使用 PCR 板，还应该记录密封方法(热合还是粘合)，因为密封方法可能会影响板周边样品的蒸发。
由于 PCR 技术的扩增效率高度依赖于所用的引物，因此应提供引物的序列。即便使用市场上购买的引物，这项规定也是完全可行的，因为各公司的引物和探针序列均公布于网上( http：//www. primerdesign.co. uk/research_with integrity. asp ) 。
此外，大力鼓励将信息提交到公共数据库如 RTprimer DB。随着时间的推移，这些数据库将会成为大众交流中心。
二级结构
8.1
核酸靶序列的结构(如 RNA 的茎环二级结构)对反转录和 PCR 的效率有重要影响。因此，引物的位置、探针和 PCR 扩增都必须考虑 RNA 模板空间折叠的问题。相关序列可用核酸折叠软件进行检查，如将 “mfold” 用于 DNA ( http：//mfold. bioinfo. rpi. edu/cgibin/dna-forml. cgi)或 RNA ( http://frontend. bioinforpi. edu/applications/mfold/cgi-bin/rna-forml-2. 3. cgi)。最好能将折叠结构提供给评阅人员。
特异性
8.2
生物信息学工具如 BLAST 软件或等效的特异性搜索工具对实验设计非常有用。应将任何明显的同源性假基因或其他未知靶标记录在案，并和比对序列一并提供给评阅人员，但特异性必须通过直接的实验数据进行验证(如电泳凝胶、熔解曲线、DNA 测序、扩增子大小和/或限制性酶切)。
立秋时节
能够预测核苷酸熔融温度(或称解链温度 Tm)的算法对实验的最初设计很有用，但最佳的退火温度必须经实验测定。虽然现在不流行对引物本身进行优化，但较差的退火优化对分析质量有很明显的影响。引物二聚体的大量存在，会得到较低的 PCR 反应效率，还可能使基于 SYBR Green I(高灵敏的 DNA 荧光染料)的分析产生假阳性结果。发表文章时应向审稿人提供引物优化的一些证据，最好以退火温度或镁离子梯度的形式提供，并以 Cq 值、荧光与循环数图和/或熔解曲线的形式呈现。
质控品和定量校准品：
8.3
在 RT-qPCR 分析中除了上述的无反转录质控品(NRT)外，其他的质控品和定量校准品也必不可少。在使用探针时，无模板质控品 (NTC) 可检测潜在的 PCR 污染，还可将 SYBR Green I 反应中的非预期扩增产物（如引物二聚体）与预期 PCR 产物区分开来。每一块反应板或每批样本中都要有 NTC，并且要确立数据排除标准。例如，若最低浓度的未知样本的 Cq 值为 35，可忽略 Cq 值≥40 的 NTC 的数据。
阳性对照（从实验样品中提取的核酸）有助于监测检测结果随时间的变化，在每次运行中不进行标准曲线时，阳性对照是必不可少的。
立秋时节
定量校准品可以是纯化的靶分子，例如涵盖完整 PCR 扩增子的合成 RNA 或 DNA 寡核苷酸、质粒 DNA、克隆到质粒中的 cDNA、体外反转录的 RNA、参考 RNA 库、来自特定生物样品的 RNA 或 DNA，或国际公认的 生物标准品（当可用时）。可以用特定浓度的 tRNA（酵母或大肠杆菌，浓度为10–100ng/L）稀释校准品。若进行人类病原体检测，可将校准品用 RNA 或 DNA 的阴性质控品稀释，或用健康人血浆稀释，并在 tRNA 载体的存在下对血浆稀释品进行裂解。对特定模板，可制备一系列稀释储备液以应对多个冰冻-解冻循环过程。若测得的 Cq 值改变了0.5 ~1.0，则应制备一批新的校准品。另外，用作标准曲线的校准品可在 4℃ 下储存1周。
在临床诊断分析上，qPCR 应有独立的被验证过的校准品，如果可能的话，校准品的值应处于分析的线性范围以内。建议使用经提取的阳性和阴性质控品。
分析性能
8.4
必须测定以下检测性能特点：PCR 扩增效率、线性动态范围、LOD 和精密度。
Part 01.PCR扩增效率
强大和精确的 qPCR 检测方法通常具有高 PCR 扩增效率的特点。在报告目的基因相对于参考基因的 mRNA 浓度时，PCR 效率是非常重要的。ΔΔCq 该方法是确定样本间浓度差异的最常用方法之一，其基础是相对参考基因进行归一化。如果计算出目的基因与参考基因 Cq 值的差异 (ΔCq)，就可以将不同样本的ΔCq值直接进行比较。值得注意的是，两种基因的扩增效率必须相当，这样的比较才准确。需要注意：最流行的方法不一定是最合适的，也有其它的定量模型用于校正扩增效率的差异、使用多个参考基因。
PCR 扩增效率必须通过标准曲线法建立，因为标准曲线法简单、快速、重现好，保证了 PCR 的平均反应效率、分析灵敏度和检测方法的稳固性。扩增效率要通过标准曲线线性部分的斜率计算，具体计算公式为：PCR 效率 = 10-1/slope-1，即以初始模板浓度的对数为X轴(自变量)，以 Cq 值为 Y 轴(因变量)作图。理论上效率的最大值为1.00(或100%)，此值表明每次循环后的产物量加倍。理想情况下，所报道的平均 PCR 效率的 CI (可信区间)或 SE (误差)值应该通过两次标准曲线法得到。
发表文章时，除了要提交每个定量靶标的标准曲线外，还要提供标准曲线的斜率和在 Y轴上的截距。PCR 效率的差异会产生不同斜率的标准曲线。随着模板量的变化，目的基因和参考基因 Cq 值的差异并非固定不变，因此，按照固定 Cq 值计算得到的相对浓度是不准确的，可能会产生误导性结果。
Cq 值 ≥40 是可疑的，因为这意味着扩增效率很低，建议不要报告。然而随意设定 Cq 临界值的做法是不科学的，因为这些值可能很低(漏掉了有效的结果)也可能很高(增加假阳性结果)。
Part 02.线性动态范围：
PCR 反应的动态范围应该呈线性，即最高或最低的定量拷贝数应该通过平均标准曲线法得到，提交的文章应该包括线性动态范围。标准曲线的产生依赖于所使用的模板，动态范围应跨越至少3 个数量级，最好跨度在5 或6 个 log10浓度范围内。标准曲线的线性区间必须包括靶标核酸的定量范围。由于定量下限的界定往往很混乱，因此应该报告提交文章中所谓线性范围内最低浓度处的变异。另外还必须报告线性相关系数(R2值)，并且最好提供整个线性动态范围内的CI值。
Part 03.检测限
检测限定义为能够检测到95%的阳性标本的最低浓度。换言之，将浓度在 LOD 水平处的待测样本进行多次重复测定，测得无效结果的概率小于5%。低拷贝 PCR 的出现是随机有限的，而且不可能发生单次 PCR 的 LOD 值小于3个拷贝数的情况。然而，如果进行多次反应，则可通过数字 PCR 获得低浓度范围的准确定量。事实上可将浓度校准品进行有限稀释，并按照泊松分布计算 PCR 反应的失败率和成功率。
Part 04.精密度：
引起 qPCR 变异的因素很多，包括影响退火和变性的温度差异、取样误差导致的浓度变异和随机误差。qPCR 的精密度主要受浓度影响，并随拷贝数增加而降低。最好进行多次重复测定并以 SD 误差线形式表示的批内变异(重复性)和标准曲线的CI(可信区间)在图中标示出来。变异系数 CV 不能用来描述 Cq，但可用来表示拷贝数或浓度的变异。技术引起的变异应区别于生物学变异。生物重复可直接解决组间或不同处理之间 qPCR 结果差异的统计学意义问题。对于诊断分析，还需要报告不同地点和不同操作者的批间精密度(重现性)。
Part 05.多重 qPCR
多重 qPCR 大大扩展了qPCR 的能力，尤其在同时检测多位点突变或多态性分析方面。多重qPCR需要提供证据证明单管中多个靶标的准确定量不会受到相互影响，例如需要证明在多重PCR下的扩增效率、LOD与单一PCR反应下保持一致。当丰度明显较低的靶标与丰度较高的靶标共同扩增时，这一问题尤为重要。
写在最后
Tips：
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未完待续，敬请关注“重读经典，MIQE 指南解读系列”，下期见~
参
考
资
料