逆转录PCR (RT-PCR )具有较高的灵敏性、操作简单等优点，常用于基因定量分析、二代测序等，此外常用逆转录PCR克隆目的基因。
cDNA的合成是RT-PCR的重要环节。以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA(complementary DNA，cDNA)，再按照PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，则可扩增出不含内含子的可编码完整基因的序列。在此过程中有3个需要重点考虑的因素，即反转录引物的策略、反转录酶的属性、RT动态范围及重复性，下面将一一为大家介绍。
▲图1. 从mRNA模板生成cDNA的步骤
通常引物策略有3种：
Oligo(dT)：
多个T碱基连接而成的寡聚引物，适用于具有Poly(A)尾的RNA。因绝大多数真核生物mRNA具有3'端Poly(A)尾，此引物可与其配对，仅mRNA可被转录，具有较高的特异性。其对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
随机引物：
多个任意的碱基连接而成的一套寡聚引物组，适合各种RNA的逆转录，包括mRNA，rRNA，tRNA均可以作为模板，尤其适合模板丰度很低的情况。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，可使用随机引物。但缺点在于，结合的随机性会造成cDNA小片段较多，非目标基因cDNA太多，有时候还会对微量目的片段造成稀释，可能会影响低丰度基因扩增。
特异性引物：
与模板序列特异性互补的引物，适用于目的基因序列已知的情况。不推荐用于第一链cDNA的合成，可用于一步法RT-PCR。在实际的应用中，通常会研究同一个个体或细胞中不同基因表达水平的变化，因此序列特异性基因相对用的少一些。
伯乐iScript Select cDNA的反转录预混液中可提供多种不同的引物（oligodT、随机引物、以及oligodT与随机引物的结合）的合成策略，扩增引物设计区域灵活，3’端还是5’端区域均可考虑。同时可以生成长链cDNA，更有利于下一步的PCR过程。
▲iScript Select cDNA合成试剂盒有助于合成长度超过6kb的cDNA
有两种常见的逆转录酶，分别是MMLV RNase H+ 和RNase H-。RNase H是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的mRNA，不水解单链或双链DNA或RNA。所以RNase H+活性控制着RNA: cDNA比率，在扩增效率一致的情况下，能够真实反应原始mRNA中基因丰度/表达量等信息。
RNase H-的逆转录酶可以合成多拷贝的cDNA，但是会导致模板基因表达量的失真。
此外，与其他几种常用逆转录酶相比，iScript Select Kit 表现出卓越的保真度。使用六种不同的常用逆转录酶之一逆转录氨苄青霉素抗性基因的部分片段。使用Bio-Rad的iProof™ High-Fidelity Master Mix进行PCR。利用Illumina MiSeq平台对产生的扩增子进行测序。对于每个样本，获得了1000万个具有三个或更多重复的有效读取碱基。通过取错误率的倒数来确定每种逆转录酶的保真度。四次重复的平均准确度为最终结果。
对于难扩增基因和低丰度基因，采用具有更大的动态检测范围的预混液更为适合。iScript™ Select cDNA合成试剂盒使用任何第一链引物方法都能稳定的超过六个数量级。此外伯乐在出厂前通过梯度稀释实验来检测反转录效率一致性，确保cDNA合成预混液的优异性能。
iScript cDNA预混液主要特点和优势：
实现高保真
独特的逆转录试剂盒可最大限度地减少碱基对错误的引入
合成长 cDNA
有效合成大于8kb的cDNA
在配置反应液的过程中节省时间并减少错误
与其他高保真逆转录酶试剂盒的方案相比，更少的手动操作时间和更少的移液步骤
检测低水平靶基因并保存 RNA
总RNA (1 µg–1 pg)的宽线性动态范围与高效RNase H+ MMLV 逆转录酶
避免 RNA 降解造成的数据偏差
RNaseA抑制剂的强效混合物可在设置和逆转录过程中保护RNA
1、Reverse Transcription (RT) (bio-rad.com)
2、Bulletin_6090 Amplification and Reagents and Plastics Brochure
* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。