In-Cell Western：原位蛋白质表达定量分析的多功能工具- 大数跨境

广州市昊洋贸易有限公司

2023-09-07

导读：蛋白质表达分析在细胞生物学研究中至关重要，它为细胞功能背后的分子机制提供了宝贵的信息。常用的分析方法，例如

蛋白质表达分析在细胞生物学研究中至关重要，它为细胞功能背后的分子机制提供了宝贵的信息。常用的分析方法，例如 Western 和 ELISA，通常用于研究细胞裂解物中的蛋白质表达。然而，这些方法需要大量的样品制备和手工操作，并且不能提供完整细胞内蛋白质空间分布的信息。In-Cell Western 作为一种替代技术，可以进行原位蛋白质表达定量和定性分析。

In-Cell Western (ICW) 使用固定和透化的细胞而不是细胞裂解物对蛋白质表达进行原位分析。它使用不同的荧光染料对多个目标进行定量，并且是一种确定大量样品中相对蛋白表达水平的快速方法。ICW 对于已经使用传统Western验证抗体特异性的研究人员或对整体蛋白质表达感兴趣的研究人员来说是理想的选择。

ICW 是一种免疫荧光测定，结合了传统Western的特异性与免疫荧光及 ELISA 的高重现性和高通量，并以多孔板中培养的细胞为样品直接进行检测。

In-Cell Western 工作流程。细胞在最多384个孔的微孔板中培养，然后固定并透化，然后与封闭缓冲液和抗体一起孵育。最后，使用成像系统（例如ChemiDoc MP ）对孔板进行成像。

在研究细胞内蛋白时，将细胞固定并透化，以允许抗体渗透，并用特异性一抗进行检测。使用不同的荧光标记二抗可以实现多重检测。洗掉未结合的抗体后，使用具有荧光功能的蛋白质迹成像仪对微孔板进行成像。产生的信号强度与细胞中存在的靶蛋白量成正比。由于消除了传统 Western 实验方案中使用的样品制备、SDS-PAGE 和转印步骤，ICW 的操作时间更少。

典型 In-Cell Western 实验方案与传统 Western 实验方案所需的总时间比较。传统 Western 可能需要7-25小时以上，通量最多为24个样品， In-Cell Western 可以在5-6小时内完成多达384个样品。

ICW 是一种多功能技术，具有广泛的应用，包括量化响应药物治疗或基因操作的蛋白质表达变化、评估蛋白质-蛋白质相互作用以及分析特定细胞区室中的蛋白质定位（Moerke 2011，Li 2010，Aguilar 2010）。ICW 还可用于筛选大型化合物库，了解其对蛋白表达的影响，使其成为药物发现和开发的有效工具。

Bio-Rad 的产品系列和我们优化的 ICW 方案可以简化您的检测。与红外或近红外 (NIR) 荧光染料偶联的二抗通常用于 ICW 多重检测和标准化。通过使用 Bio-Rad 的ChemiDoc MP 成像系统，该成像仪能够在单个采集步骤中多重检测多达三个目标，具有五个荧光通道，提供卓越的图像质量。研究人员可以利用广泛的荧光标记二抗，这些二抗可与 Bio-Rad 的即用型 hFAB 罗丹明管家蛋白荧光一抗配合使用。

ChemiDoc MP 成像系统上成像并使用 Image Lab 软件进行分析的多重 In-Cell Western 板的样本图像。将 HEK293 细胞以5k、10k、25k、50k、75k和100k细胞/孔接种在重复的列中，并探测 Actin Gamma（MCA5776GA、DyLight 680，红色）、p53（VMA00664、DyLight 800，绿色）和 HKP 对照 GAPDH（12004167，罗丹明，灰色）。

ChemiDoc MP 成像仪完美配合，利用这个功能强大而简单的软件包轻松进行 ICW 分析。可以使用 Bio-Rad 专用 In-Cell Western 应用页面上提供的模板，还是使用 Volume Tool 创建自己的模板，Image Lab 软件都会自动计算每个孔的信号强度。与 Bio-Rad 的 hFAB 罗丹明管家蛋白荧光一抗结合使用时，您可以设置对照孔和空白孔，用于背景扣除以计算调整后的体积强度。